不同產源艾納香油抗菌活性篩選及其對金黃色葡萄球菌抗菌作用的研究

高 月，王萬林，彭俊超，蔡亞玲，廖加美，易 瓊，王 魯*

(1.西南特色藥用生物資源開發利用教育部工程研究中心，貴陽 550025；2.貴州省生化工程中心，貴陽 550025；3.貴州大學 藥學院，貴陽 550025)

在日常飼料中添加抗生素類藥物，具有防控動物細菌性疾病和促動物生長作用，但抗生素的濫用容易引起細菌的耐藥、畜產品的安全及公共衛生等問題，而中獸藥在確保畜禽健康方面取得的成績得到了廣泛認可，尋找新的中藥、發揮中醫藥的優勢保障動物的健康更顯突出。艾納香油是貴州地道藥材艾納香Blumeabalsamifera(L.)DC.提取艾片的附屬產品，具有廣泛的生物活性[1-6]，主要含有L-龍腦、樟腦、α-蒎烯、β-蒎烯、芳樟醇、β-石竹烯等[7-9]化合物。目前，有文獻報道艾納香及活性成分具有抗菌作用[10-11]，但用藥量均太大(大多數是mg·mL-1)，前期研究發現艾納香油對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)[12]、副豬嗜血桿菌[2]具有良好的抗菌活性，由于當前市場上沒有艾納香油的質量控制標準，不同來源的艾納香油由于化學組成差異，其活性有所不同[13]。為此，本文旨在通過體外抗菌試驗篩選抗菌活性好的艾納香油，并篩選其活性成分，為艾納香油質量標準的制定提供物質基礎，并對艾納香油對S.aureus的抗菌作用進行研究，為其在畜禽養殖業進一步的研究應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

S.aureus(ATCC 13565)、E.coli(ATCC 25922)、銅綠假單胞桿菌(Pseudomonsadaceae，P.arugino.saATCC 27853)、無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae，GBSATCC 13813)、白色念珠菌(CandidaalbicansATCC 10231)均購自中國藥品生物制品檢定所。SPF級昆明小白鼠，購自于解放軍第三軍醫大學實驗動物中心[動物許可證號：SCXK(渝)2012-0003]。艾納香油A1～A5分別購自于貴州省羅甸縣、望謨縣5個生產艾納香油的公司或農戶[13]，艾納香莖葉購自于貴州省羅甸種植戶，經貴州大學農學院王華磊教授鑒定為植物艾納香Blumeabalsamifera(L.)DC.的莖葉，(-)-龍腦、樟腦、(-)-芳樟醇、(+)-芳樟醇、(+/-)-芳樟醇、創愈醇、六氫金合歡烯酰丙酮、反式-石竹烯、氧化石竹烯、(-)-β-蒎烯、(+/-)-α-蒎烯、(-)-α-蒎烯、(+)-α-蒎烯、α-葎草烯、吐溫-80分別購自于上海源葉生物科技有限公司、上海同田生物技術股份有限公司。

1.2 主要儀器

HP6890/5975C GC/MS聯用儀(Agilent公司)，MultiskanGo型全波段酶標儀(Thermo Fisher scientific公司)，S-3400 N掃描電子顯微鏡(HITACHI(日立)公司)。

1.3 艾納香油制備

按中國藥典(2015年版)第四部通則揮發油測定儀器裝置，參考前期研究[14]采用正交設計提取的9個艾納香油，分別為B1～B9，正交試驗設計優化提取工藝獲得的艾納香油為T。

1.4 不同產源的艾納香油體外抗菌活性檢測

1.4.1 艾納香油溶液配制 不同產源的艾納香油(表1)與吐溫-80以1∶1比例混懸后，溶于液體培養基，原溶液濃度配制為7、5 mg·mL-1備用。

1.4.2 抑菌圈的測定 參照CLSI2017標準，采用瓊脂擴散法，參考文獻[15]將細菌菌液調整至108CFU·mL-1、真菌菌液調整至107CFU·mL-1備用，每孔加入100 μL艾納香油溶液，細菌置37 ℃恒溫培養18～24 h，真菌置28 ℃恒溫培養48 h，游標卡尺按十字交叉測量抑菌圈直徑，每試驗重復3次。

1.4.3 MIC、MBC測定 參照CLSI2017標準，采用肉湯微量稀釋法、瓊脂平板計數法[16]，按倍半稀釋法將艾納香油原溶液進行梯度稀釋，96孔板中分別給予艾納香油溶液各100 μL，加入菌懸液各100 μL。細菌置37 ℃恒溫培養18～24 h，真菌28 ℃ 靜置恒溫培養48 h，孔內溶液澄清無沉淀為藥物對該菌的MIC值。吸取澄清孔內的菌液接種于瓊脂平板上，觀察菌落生長情況，菌落總數<5個為藥物對該菌的MBC值。各試驗重復3次。

1.5 艾納香油中抗菌活性成分檢測

1.5.1 GC-MS比較分析主要化學成分 參考文獻[13]采用GC-MS法對自制的艾納香油B5、B9及T進行化學成分檢測分析，比較其主要化學成分含量。

1.5.2 艾納香油中部分化合物抗菌活性檢測 根據GC-MS分析結果，將(-)-龍腦、樟腦、石竹烯氧化物等化學成分與吐溫-80以1∶1比例混懸后，溶于細菌培養基，原溶液濃度配制為7、5 mg·mL-1備用。按“1.4.3”操作方法，測定艾納香油中部分化合物對S.aureus、P.arugino.sa的MIC、MBC值。

1.6 艾納香油T對S. aureus感染小鼠的影響

取(28±2)g小鼠50只，雌雄各半，隨機分為5組，空白組、模型組、艾納香油T高劑量組、艾納香油T中劑量組、艾納香油T低劑量組、溶劑組，根據預試驗結果，艾納香油T3個劑量組小鼠分別灌胃20、10、5 mg·mL-1的艾納香油T溶液0.3 mL·只-1，空白組灌胃等量生理鹽水，溶劑組灌胃等量吐溫-80，連續灌胃7次，每天1次，第7天灌胃后30 min腹腔注射S.aureus0.2 mL·只-1，攻菌量為5.0×109CFU·mL-1，空白組腹腔注射等量生理鹽水，觀察小鼠活動，死亡的立即剖解觀察各臟器病變。試驗觀察7 d，觀察小鼠死亡情況，7 d后沒有死亡的第8天處死小鼠，剖解觀察各臟器病變，特別注意觀察腎病變[17]情況。

1.7 艾納香油T對S. aureus 生長的影響

滅菌的肉湯培養基中加入艾納香油T溶液，使其藥物終濃度分別為0.25～4.00 MIC，分別加入菌懸液后于37 ℃、120 r·min-1搖床培養，分別于0、1、3、6、9、12、15、24、48 h取出，測其在OD600 nm時的吸光值，以時間為X軸，OD600 nm值為Y軸繪制S.aureus的生長曲線，每試驗重復3次。

1.8 艾納香油T對S. aureus形態的影響

培養至對數生長期的S.aureus中加入1、2 MBC的艾納香油T，37 ℃培養12 h，按照掃描電鏡常規方法制備樣品，于掃描電鏡下觀察細菌形態變化情況。每組設置3個重復，各試驗重復3次。

1.9 統計學處理

采用SPSS17.0統計軟件對試驗數據進行分析，組間數據比較采用單因素方差分析(ANOVA)，動物死亡率及檢出率采用Χ2分析，以P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 不同產源艾納香油對受試菌株的抗菌效果

2.1.1 抑菌圈測定結果 表1結果顯示，不同產源艾納香油對受試菌株抑菌圈大小均不同，大多數艾納香油對S.aureus、P.arugino.sa的抑菌圈直徑(D)為14～24 mm。根據文獻[18]藥敏試驗判斷標準為中介(15～19 mm)或敏感(≥20 mm)，其中，艾納香油B4、B9、T為敏感，抑菌圈直徑均>20 mm。而對E.coli、GBS、Candidaalbicans的抑菌圈直徑<4 mm，為耐藥。

表1 不同產源艾納香油對受試菌的抑菌圈直徑

2.1.2 MIC、MBC測定結果 根據表2結果可知，不同產源的艾納香油對S.aureus、P.arugino.sa的MIC值為9.77～78.13 μg·mL-1、MBC值19.54～312.50 μg·mL-1，其中，艾納香油B9、T對S.aureus的MIC值為9.77 μg·mL-1、MBC值為19.54 μg·mL-1，對P.arugino.sa的MIC值為13.68 μg·mL-1；MBC值為27.35 μg·mL-1，根據文獻[19]藥敏試驗判斷標準為中介(8 μg·mL-1

表2 不同產源的艾納香油對受試菌株的MIC、MBC結果(n=3)

2.2 艾納香油中活性成分檢測

2.2.1 艾納香油化學成分分析結果 選取艾納香油B5、B9、T進行GC-MS聯用分析，主要化學成分如表3所示，所測試樣本中化學成分大致相同，共檢測出(-)-龍腦、氧化石竹烯、γ-桉葉油醇、反式-石竹烯、α-桉葉油醇、β-桉葉油醇、樟腦、別香橙烯等36個化合物為共有化學成分，但各油中的主要化學成分百分含量相對占比各不相同。

表3 GC-MS分析B5、B9、T主要化學成分

2.2.2 抗菌化學成分篩選結果 從表4可知，艾納香油中單體化合物對S.aureus、P.arugino.sa表現出不同的抑菌效果。其中，含量較低的α-葎草烯對S.aureus、P.arugino.sa的MIC值分別為19.54、39.07 μg·mL-1，蒎烯類化合物的MIC值均為78.13～156.25 μg·mL-1。芳樟醇類化合物對S.aureus、P.arugino.sa的MIC值均為156.25～312.50 μg·mL-1，MBC值均為625.00～875.00 μg·mL-1；而含量較高的(-)-龍腦等化學成分的MIC值均>1 000 μg·mL-1

表4 化學成分對受試菌株的MIC、MBC結果(n=3)

2.3 艾納香油T對S. aureus感染小鼠的保護性試驗

與空白組相比，溶劑組、模型組小鼠感染S.aureus后精神萎靡，活動減少、行動緩慢，身體顫抖，試驗期間小鼠死亡率均達60%(P<0.05)，無論是試驗期間還是第8天處死的小鼠，腎病變檢出率、脾體積均明顯增加，差異極顯著(P<0.01)；艾納香油T溶液低、中、高劑量組對小鼠感染S.aureus后活動及精神狀況均有所改善，小鼠死亡率呈濃度依賴性減少分別為50%、40%、20%，脾腫大和腎病變檢出率與模型組相比據其濃度不同也有不同程度減少，差異極顯著(P<0.01)。結果詳見表5、圖1。

表5 艾納香油T抗S.aureus感染小鼠影響的結果

K.空白組；M.模型組；T-80.溶劑對照組；A.20 mg·mL-1 T組；B.10 mg·mL-1T組；C.5 mg·mL-1T組

2.4 艾納香油T對S. aureus生長的影響

如圖2可知，溶劑組菌株的生長趨勢與對照組相同，在6 h后進入對數生長期，具有完整的生長周期。當T溶液濃度為0.25、0.5 MIC作用S.aureus后，菌株在9 h內無明顯增殖現象。當T溶液濃度達1MIC時，菌株在24 h內處于抑制狀態，無增殖現象，24 h后變化明顯；而當T溶液濃度達到2MIC或更高時，S.aureus在48 h內生長曲線幾乎維持在水平狀態，均無增殖現象。

圖2 艾納香油T對S.aureus生長的影響

2.5 艾納香油T對S. aureus形態的影響

掃描電鏡下觀察結果如圖3可知，對照組S.aureus呈葡萄串狀，菌體和表面完整光滑且外觀飽滿。與對照組相比，艾納香油T溶液作用S.aureus后，當濃度為1 MBC時，菌體表現出嚴重的形態學破壞，菌體分散，表面明顯出現褶皺，有不規則凸出及凹陷結構；當濃度為2 MBC時，菌體遭到破壞，表面褶皺、變形嚴重，出現大規模破碎等現象。

圖3 艾納香油T對S.aureus菌形態的影響

3 討 論

由于人們越來越重視動物源性食品的安全衛生，許多國家已先后作出了限用和禁用在飼料中添加抗生素的決定，我國農業農村部2019年7月10日發布194號公告中明確指出“退出除中藥外所有促生長類藥物飼料的添加劑品種”，如何做到不使用抗生素，確保畜禽的健康，使得尋找新的中藥、發揮中醫藥的優勢以保障動物的健康更顯突出。本文參照美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)推薦的西藥體外藥敏試驗標準[18-19]，對貴州不同產源的艾納香油進行抗菌活性的篩選，篩選出艾納香油B9、T抗菌效果最好，S.aureus和P.arugino.sa對艾納香油B9、T敏感或中介。艾納香油(T)是最佳提取方法獲取的艾納香油，且抗菌效果較強，可作為后續抗菌活性研究開發的試驗材料。

艾納香油對蠟樣芽胞桿菌的MIC為0.15 mg·mL-1，對S.aureus和白色念珠菌的MIC為1.2 mg·mL-1[20]；艾納香油對黃曲霉、黑曲霉等MIC值均為0.625 mg·mL-1，對S.aureus、E.coli、綠膿桿菌的MIC值分別為1.25、2.50、2.50 mg·mL-1[21]；艾納香中L-龍腦對S.aureus、E.coli、李斯特菌、沙門菌等菌的MIC值均為1.00 mg·mL-1，對紅色毛癬菌、假絲酵母菌MIC值均為0.25 mg·mL-1，對黑曲霉MIC值為0.50 mg·mL-1[10]。從這些數據看，艾納香油用藥量均太大(大多數是mg·mL-1)，而本研究的用量是μg·mL-1級，且研究結果是通過反復驗證過的，說明艾納香油抗菌活性是確定的。

目前，中獸藥抗菌物質不清楚，抗菌效果不穩定，使用劑量過大，作用機制不明確成為畜牧業上應用的“瓶頸”問題。為尋找艾納香油中的抗菌活性物質，對艾納香油B5、B9、T進行GC-MS聯用檢測分析出共有化學成分36種，且各百分含量均不相同，其中艾納香油中含量均較高的(-)-龍腦、氧化石竹烯、創愈醇、六氫金合歡烯酰丙酮等化合物無明顯抗菌效果。而含量較低的α-葎草烯、蒎烯及芳樟醇類化合物具有一定的抑菌活性，其中，α-葎草烯抑菌效果較好。至于尋找艾納香油中具有良好抗菌活性的其他化合物或組合，需引入現代更先進的科學方法和技術以獲取其抗菌物質。

體內保護試驗結果顯示，動物模型中腎病理變化與文獻報道病變[22-23]一致，艾納香油對S.aureus感染小鼠有保護作用，且具有濃度依賴性特點，隨濃度的升高能預防S.aureus感染小鼠后引起的腎、脾病變的發生。通過不同濃度艾納香油T溶液作用S.aureus后能不同程度抑制菌株生長，與其他抗菌類藥物[24-26]的生長曲線一致。當艾納香油T溶液濃度≥2 MIC時，菌體形態發生改變，菌體完整性遭到破壞而導致菌株死亡，這將為進一步抗菌作用機制的研究提供試驗條件。但具體是通過破壞菌細胞形態、細胞膜破裂導致內容物釋放，還是靶向作用菌株后抑制細菌細胞壁合成、抑制核酸的復制與修復、抑制蛋白質合成而破壞細菌的生長而發揮作用，還有待于進一步地深入研究。

4 結 論

艾納香油對S.aureus和P.arugino.sa具有良好的抗菌活性，篩選出艾納香油B9、T抗菌效果最好，S.aureus和P.arugino.sa對艾納香油B9、T敏感或中介。不同產源的艾納香油抗菌活性略有差異，其化學成分大致相同，但主要化學成分的相對占比各不相同，其中，α-葎草烯、蒎烯和芳樟醇類化合物可能是抑菌關鍵物質。艾納香油T對S.aureus感染小鼠有保護作用，呈濃度依賴性抑制S.aureus的生長，可通過壞菌體的完整性，影響細菌生長。