枳實飲片質量控制方法的優化

劉 靜，吳怡青，張 雪，趙苑伶，劉 妍，陳 揚，李芝奇，趙崇軍，馬志強*(1.北京中醫藥大學中藥學院，北京 100102；2.中藥品質評價北京市重點實驗室，北京 100102)

枳實為我國的大宗藥材之一，來源于蕓香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)及其栽培變種或甜橙(CitrussinensisOsbeck)的干燥幼果，具有破氣消積、化痰散痞的功效，主要用于治療積滯內停、痞滿脹痛、大便不通、痰阻氣滯等癥[1]。枳實始載于《神農本草經》，臨床應用歷史悠久且廣泛，在《傷寒雜病論》中，枳實被應用于19首經方，占經方總數的7.3%，其中大承氣湯、小承氣湯、四逆散、麻子仁丸、枳實芍藥散、排膿散等皆為臨床常用方[2]。現代藥效學研究表明，枳實主要有改善腸燥便秘[3]、促進胃腸動力[4]、護肝[5-6]、升壓、抗休克[7]、改善心臟血流[8-9]、加快新陳代謝和脂質代謝[10]等藥理作用，發揮這些藥理作用的有效成分為黃酮苷類和生物堿類。其中辛弗林為《中國藥典》中規定的須同時做定性鑒別和含量測定的指標性成分[1]。以藥效作用為導向[11]，必須完善黃酮苷類和生物堿類成分的分析檢測體系。

能否高效地分析、檢測生物堿和黃酮苷類成分，直接決定了能否科學、客觀地評價枳實的藥材質量，經查閱藥典及有關枳實質量控制的文獻發現：①目前，已有的測定辛弗林含量的方法為，選用C18色譜柱，以甲醇-磷酸二氫鉀溶液(取磷酸二氫鉀0.6 g，十二烷基磺酸鈉1.0 g，冰醋酸1 mL，加水溶解并定容至1 000 mL)(50∶50)為流動相，檢測波長為275 nm[1,12-15]。筆者經過嘗試發現，使用該方法時由于流動相組成較復雜，致使色譜柱和液相系統壓力高，有時會使實驗中斷；使用后不易沖洗干凈，容易折損色譜柱和儀器的使用壽命；且十二烷基磺酸鈉為離子表面活性劑,會使流動相產生泡沫，從而造成基線不穩、出峰時間不穩定、峰形差等問題。另外，該方法還有流動相配制過程繁瑣，檢測時間較長等缺點。②辛弗林的薄層色譜鑒別多采用正丁醇-冰醋酸-水系統[1,16]、氯仿-甲醇-氨水系統[17-18]，但采用這2個展開系統時辛弗林斑點成點性不好，分離度欠佳。③此外，雖然對橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷4種黃酮苷的定量研究較為成熟[19-22]，但定性研究目前尚無報道。因此，為了能夠為規范枳實藥材質量提供科學、快速、簡便、直觀的檢測方法，本研究開發出了新的辛弗林定性、定量分析方法及4種黃酮苷的定性鑒別方法，新建立的方法分離度好，專屬性強，克服了原有方法的缺陷，彌補了已有方法的不足，可為枳實的質量評價奠定基礎。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters e2695型高效液相色譜儀(美國沃特世公司)；十萬分之一電子分析天平[梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司]；KQ-500DE型數控超聲波清洗器(江蘇昆山市超聲儀器有限公司)；FW100型高速萬能粉碎機(北京科偉永興儀器有限公司)；DZKW-4型電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業儀器有限公司)；ZF-7型暗箱三用紫外線分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)；定量毛細管、展開槽均購自華西醫科大學儀器廠；硅膠G板(批號20170220，青島海洋化工廠)；聚酰胺薄板(批號2019042，浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠)。

1.2試藥 橙皮苷(批號CHB180418)、新橙皮苷(批號CHB180316)、柚皮苷(批號CHB180729)、蕓香柚皮苷(批號CHB180917)，質量分數均在98%以上，均購自成都克洛瑪生物科技有限公司；辛弗林(批號DSTDX002001，質量分數大于98%)，N-甲基酪胺鹽酸鹽(批號DSTDJ026801，質量分數大于95%)，均購自成都德思特生物科技有限公司；枳實(酸橙)對照藥材(中國食品藥品檢定研究院，批號120936-201606)；19批枳實飲片由北京中醫藥大學楊瑤珺教授鑒定為蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培變種的干燥幼果，來源信息詳見表1；乙腈、乙酸銨為色譜純，購自美國賽默飛世爾科技有限公司；其他試劑均為分析純。

表1 枳實飲片來源信息Tab.1 Source information of the decoction pieces of Aurantii Fructus

2 方法與結果

2.1薄層色譜鑒別

2.1.14種黃酮苷對照品和供試品溶液的制備 精密稱取橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷對照品，加入甲醇配制成質量濃度分別為1.02、1.04、1.24、1.64 mg·mL-1的對照品溶液。吸取上述對照品溶液各2 μL點樣，吸取上述對照品溶液各1.5 μL混合點樣于聚酰胺薄層板上的同一點。

稱取枳實中粉約0.1 g，置于50 mL錐形瓶中，加入25 mL甲醇，超聲(40 kHz，500 W)處理40 min，靜置，取上清液5 μL點樣。

2.1.22種生物堿對照品和供試品溶液的制備 精密稱取辛弗林、N-甲基酪胺對照品，加入甲醇配制成質量濃度分別為1.17、0.75 mg·mL-1的對照品溶液，各吸取2 μL點樣。

精密稱取枳實中粉0.2 g，加入體積分數為30%的甲醇溶液25 mL，超聲(40 kHz，500 W)處理45 min，同法再提取1次，合并2次的過濾液轉移至50 mL量瓶中，用體積分數為30%的甲醇溶液定容至刻度，搖勻，過0.45 μm濾膜，取續濾液10 μL作為高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法供試品溶液。剩余藥液蒸干，加入15 mL甲醇溶解，吸取10 μL點樣。

2.1.3展開、顯色及檢視 依據薄層色譜(《中國藥典》2020年版通則0502)，按2.1.1項下方法，吸取相應量的4種黃酮苷的對照品溶液與供試品溶液點于同一塊聚酰胺薄層板上，以石油醚-氯仿-丙酮-乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸(1∶13∶3∶3∶2∶1.2)為展開劑，上行展開，取出晾干，噴以質量濃度為0.1 g·mL-1的三氯化鋁乙醇溶液，在365 nm紫外光下檢視。同法，按2.1.2項下點樣量，吸取2種生物堿的對照品溶液和供試品溶液點于同一塊硅膠G板上，以氯仿-甲醇-丙酮-體積分數25%的氨水-三乙胺(3∶3∶3∶0.9∶0.15)為展開劑進行展開，取出晾干，噴質量濃度為0.005 g·mL-1的水合茚三酮溶液，并于烘箱中105 ℃加熱至顯色。

在19批供試品的色譜中，在與對照品、對照藥材色譜相應的位置上，均顯相同顏色的斑點。見圖1和圖2。

圖1 19批枳實飲片中4種黃酮苷成分薄層色譜結果注：Ⅰ～Ⅳ分別為橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷對照品；Ⅴ為混合對照品；Ⅵ為枳實對照藥材；數字1～19表示編號S1～S19的枳實飲片。Fig.1 TLC results of 4 flavonoid glycosides in 19 batches of the decoction pieces of Aurantii FructusNotes:Ⅰ-Ⅳ respectively represents hesperidin，neohesperidin,naringin,narirutin reference substances;Ⅴ as the mixed reference substances.Ⅵ as standard medicinal materials;Numbers 1-19 respectively represents the serial numbers S1-S19 the decoction pieces of Aurantii Fructus.

圖2 19批枳實飲片中辛弗林、N-甲基酪胺薄層色譜結果注：Ⅰ為混合對照品，上、下2個斑點分別為辛弗林、N-甲基酪胺所顯示的紫紅色斑點；Ⅱ為枳實對照藥材；數字1～19表示編號為S1～S19的枳實飲片。Fig.2 TLC results of synephrine and N-methyltyramine in 19 batches of the decoction pieces of Aurantii FructusNotes:Ⅰ was mixed reference substances，the upper and lower spots were purplish red spots of synephrine and N-methyltyramine，respectively；Ⅱ was standard medicinal materials;Numbers 1-19 respectively represents serial numbers S1-S19 the decoction pieces of Aurantii Fructus.

2.1.4薄層色譜結果分析 由圖1、圖2可見，圖中斑點均勻，成點性良好，分離度好，無其他成分干擾，Rf值均在0.2～0.8范圍內，表明本研究所開發的6種成分薄層色譜方法符合《中國藥典》的要求，可應用于枳實飲片的定性鑒別中。由圖1可見，枳實飲片大致可分為兩類，S17、S15、S14、S11、S1枳實飲片的色譜條帶與Ⅵ枳實(酸橙)對照藥材及其余批次枳實飲片色譜條帶相比有明顯不同，且新橙皮苷、柚皮苷的斑點幾乎缺失，表明這些批次的枳實飲片中所含成分的種類與其他批次的藥材有差別，且新橙皮苷、柚皮苷成分含量極少或不含有。由圖2可見，各批次枳實飲片的色譜條帶相似，但由于辛弗林、N-甲基酪胺含量差異導致所呈現斑點的顏色深淺不一。由此表明，在枳實的定性鑒別中，4種黃酮苷的薄層色譜能夠更直觀、更清楚地反映各批次枳實飲片的差異，因此在枳實飲片質量評價中建議增加4種黃酮苷的薄層色譜鑒別項目；各批次枳實飲片存在較大差異反映了加強枳實藥材質量管理的急迫性與必要性，提示中藥材必須在其栽培管理、采收、加工、運輸、貯存等各個環節中保證相關信息的真實性與完整性，才能從源頭上保證藥材質量。

2.2HPLC含量測定

2.2.1色譜條件 色譜柱：YMC-Pack ODS-A柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測波長：272 nm；柱溫：35 ℃；流動相：乙腈-2 mmol·L-1乙酸銨水溶液(8.5∶91.5)等度洗脫；流速：0.8 mL·min-1；對照品溶液與供試品溶液進樣體積各10 μL；理論塔板數按辛弗林峰計算不低于3 000。

2.2.2辛弗林對照品溶液的制備 精密稱取辛弗林對照品3.00 mg，加入體積分數為30%的甲醇制得質量濃度為300.00 μg·mL-1的辛弗林對照品溶液。

2.2.3供試品溶液的制備 詳見2.1.2。

2.2.4系統適用性實驗 按照2.2.1項下色譜條件，對照品溶液和供試品溶液均進樣10 μL。在對照品溶液和供試品溶液的色譜圖中，辛弗林的保留時間約為4.6 min，且與其他色譜峰分離度良好，無干擾，拖尾因子符合要求。液相色譜圖見圖3。

圖3 HPLC圖注：A.對照品溶液；B.供試品溶液；1.辛弗林。Fig.3 HPLC chromatogramsNotes:A.reference solution；B.sample solution;1.synephrine.

2.2.5線性關系考察 精密吸取2.2.2項下的辛弗林對照品溶液(質量濃度為300.00 μg·mL-1)，以體積分數30%的甲醇逐級稀釋成質量濃度為300.00、150.00、75.00、37.50、18.75 μg·mL-1的溶液，分別精密吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積。以辛弗林的色譜峰面積(y)對對照品質量濃度(x)進行線性回歸。辛弗林的線性回歸方程為：y=1 985.6x-2 610.3，R2=0.999 8，表明辛弗林質量濃度在18.75～300.00 μg·mL-1范圍內線性關系良好。

2.2.6重復性考察 精密稱取S19枳實中粉6份，每份0.2 g，按照2.1.2項下的方法制備供試品溶液，測定辛弗林色譜峰面積，經計算可知辛弗林的平均含量為4.64%，RSD值為2.37%，結果符合要求，說明本檢測方法的重復性良好。

2.2.7精密度考察 精密稱取S19枳實中粉0.2 g，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，重復進樣6次，記錄辛弗林色譜峰的面積，計算RSD值。結果辛弗林色譜峰面積的RSD值為0.79%，說明儀器的精密度良好。

2.2.8中間精密度考察 由本實驗室其他2名實驗人員按2.1.2項下方法分別制備供試品溶液，在不同時間分別選用2臺不同的高效液相色譜儀，按照2.2.1項下的色譜條件，重復進樣6次，測定辛弗林色譜峰的峰面積，計算其RSD值。2位實驗人員計算得辛弗林色譜峰面積的RSD值分別為0.81%、0.47%，結果表明實驗方法可靠，中間精密度良好。

2.2.9穩定性考察 選用2.2.8項下已制備好的供試品溶液，分別于制好后的2、4、12、24、36、48 h進樣，進行檢測分析，測定辛弗林色譜峰的峰面積，經計算可知，其RSD值為0.97%，表明供試品溶液在48 h內穩定性良好。

2.2.10耐用性考察 精密稱取S19枳實中粉0.2 g，按2.1.2項下方法制備供試品溶液,分別在流速為0.795、0.80、0.85 mL·min-1，柱溫為30、35 ℃，檢測波長為270、272、275 nm等色譜條件下進行辛弗林峰面積的測定，所得RSD值均小于1.50%。表明在略微改變色譜條件中的流速、而柱溫和檢測波長固定不變的條件下，或略微改變柱溫、流速和檢測波長保持不變的條件下，或略微改變檢測波長、流速和柱溫不變的條件下，本方法的耐用性均較好。

2.2.11準確度考察 精密稱取已知含量的S14枳實飲片中粉(辛弗林含量2.23%)0.1 g，共6份，分別精密加入質量濃度為1.115 mg·mL-1的辛弗林對照品溶液1 mL，通過揮發去除溶劑。按照2.1.2項下方法制備供試品溶液，進樣測定辛弗林色譜峰的面積，經計算可知平均回收率為100.32%，RSD值為2.79%。

2.2.12樣品含量測定 準確稱取編號為S1～S19的枳實飲片中粉，每個編號的樣品各取2份，每份約0.2 g，按照2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件測定辛弗林色譜峰的面積，每一供試品溶液各測定2次，計算含量，結果見表2。

表2 19批枳實飲片中辛弗林含量的測定結果Tab.2 Determination results of synephrine content in 19 batches of the decoction pieces of Aurantii Fructus

《中國藥典》2020年版一部中規定：枳實以干燥品計算，含辛弗林不得少于0.30%[1]。19批枳實飲片中辛弗林含量最低為1.82%，最高為4.71%，含量差異較大，因此建議上調辛弗林的含量標準，同時建立枳實飲片的質量評價等級，以便對枳實飲片的等級進行管理，從而實現優質優價的市場規范，并確保臨床精準的用藥量。在19批樣品中，江西產地樣品中的辛弗林含量為1.82%～4.24%；四川產地樣品(S4、S10)中的辛弗林含量分別為2.04%、2.65%；重慶產地(S2、S3、S19)樣品中的辛弗林的含量分別為3.57%、2.51%、4.71%。自近代以來，皆以江西產區的江枳實為道地藥材，從本研究獲得的數據來看，建議加強對重慶產枳實的研究力度，以擴大藥源，滿足市場需求。

3 討論

3.1薄層鑒別展開系統的優選 參考《中國藥典》及有關文獻，嘗試了正丁醇-冰醋酸-水[1,16]、氯仿-甲醇-濃氨水[17-18]等展開系統，根據展開效果不斷調整試劑的種類和比例，最終確定了氯仿-丙酮-甲醇-體積分數10%的氨水-三乙胺(3∶3∶3∶0.9∶0.15)的展開系統，可同時定性鑒別辛弗林、N-甲基酪胺2種成分。同樣根據4種黃酮苷的極性大小，在實驗中不斷嘗試各種試劑，仔細觀察每種試劑和比例對展開效果的影響，最終建立了石油醚-氯仿-丙酮-乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸(1∶13∶3∶3∶2∶1.2)的展開條件。但由于實驗條件的限制，未能使用全自動點樣儀，全部操作皆為手動，因此不能保證點樣量的準確性，且顯色劑噴灑均勻與否也會影響薄層板色譜圖的顯示結果。本研究所開發的2種薄層鑒別方法均通過了方法學考察，考察因素包括不同溫度、不同濕度、不同預飽和時間及不同廠家不同批次的薄層板。

3.2HPLC條件的優化及供試品制備方法的考察 采用光電二極管陣列檢測器全波長掃描，確定辛弗林的最大吸收波長為272 nm。辛弗林分子中存在酚羥基和氨基，具有兩性性質，因此考慮選用乙酸銨(緩沖離子對試劑)溶液作為流動相，并進行了濃度考察，確定了流動相為乙腈-2 mmol·L-1乙酸銨水溶液。并采用單因素考察，以辛弗林色譜峰峰形、分離度為指標，確定了柱溫為35 ℃、流速為0.8 mL·min-1。

供試品溶液制備中，采用單因素考察了以下因素：提取方式(加熱回流提取、超聲提取)；提取溶劑(水，甲醇，體積分數為30%、50%、80%的甲醇，乙醇，體積分數為30%、50%、80%的乙醇)；溶劑用量(25、35、45 mL)；提取時間(20、30、40 min)；提取次數(1、2、3次)。根據辛弗林的提取率確定了供試品溶液的制備方法。

3.3方法的評價 本實驗在優化枳實定性、定量研究方法的同時，將優化后的方法應用于3個產地共19批枳實飲片藥效成分的檢測中，結果表明本研究建立的方法適用性強，專屬性強，穩定性、分離度良好，且簡便易操作。本研究建立了4種黃酮苷的定性鑒別方法，優化了生物堿的定性、定量方法，與現有方法相比，能夠更全面地反映枳實質量控制成分的信息特征，為多指標成分評價枳實質量奠定基礎。