芍甘附子湯加味對CIA大鼠關節滑膜病理及血清IL-2、IL-17A與TNF-α表達水平的影響*

張玉婷，侯秀娟，劉小平，朱躍蘭

（1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.北京中醫藥大學東方醫院風濕科，北京 100078）

類風濕關節炎（RA）是一種常見的慢性、全身性自身免疫性疾病，以對稱性、多關節炎為主要特點。RA病程長且常常反復發作，具有發病率高和致殘率高的特點，嚴重危害患者的身心健康，影響患者的生活質量。RA的發病機制復雜，病因尚未完全闡明，多種促炎因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-17、IL-6、IL-1、IL-21及 IL-22等在RA的發病過程中起重要作用[1]。輔助性T細胞17（Th17）以及IL-17在RA發病中的重要作用越來越受重視[2-4]。其中，IL-17A通過相關信號轉導通路，可從多個方面加重RA關節處炎癥程度和關節損害[5]。此外，臨床上針對TNF-α、IL-1及IL-6的靶向藥物應用較廣泛，此類生物制劑具有起效快、抑制骨破壞明顯等特點。本病屬于中醫“痹證”范疇，中醫藥干預RA具有不良反應小、依從性好等特點。本實驗通過建立膠原誘導性關節炎（CIA）模型，探討芍甘附子湯加味對CIA大鼠模型關節病理改變及血清炎性細胞因子IL-2、IL-17A及TNF-α的干預作用。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級雌性Wistar大鼠24只，體質量（200±20）g，由北京維通利華實驗動物技術公司提供，動物許可證號：SCXK（京）2012-0001，適應性喂養1周。

牛Ⅱ型膠原（CⅡ，批號：20022）購自美國Chondrex公司；不完全弗氏佐劑（IFA，批號：7002）購自美國Sigma公司；IL-2酶聯免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒、IL-17A ELISA檢測試劑盒及TNF-α ELISA檢測試劑盒均購自北京歐北生物科技有限公司；切片機（德國 Leica）；攤片機（德國 Leica）；包埋機（德國Leica）；自動脫水機（德國Leica）；倒置顯微鏡（Olymp）。

芍甘附子湯加味，方藥組成：制附子15 g，白芍15 g，甘草 10 g，雞血藤 15 g，青風藤 15 g（以上藥物由北京中醫藥大學東方醫院藥劑科統一采購，實驗過程中保證所用藥品為同一批次，并由北京中醫藥大學中藥學院中藥鑒定教研室鑒定質量控制），用前全部藥材經煎煮（制附子先煎30 min）并過濾，水浴蒸發至其治療劑量每1 mL藥液含生藥材1.42 g。雷公藤多苷片：10 mg×100片/盒，購自湖南千金協力藥業有限公司，批準文號：Z43020138，用前蒸餾水配制為1 mg/mL。

1.2 造模及分組 將24只大鼠隨機分出6只作為正常組，其余18只均建立CIA模型，造模成功后再隨機分為模型組、雷公藤組、芍甘附子湯組，每組6只大鼠。造模方法：CⅡ溶于乙酸，與等體積IFA溶液混合，制備CⅡ終濃度2 mg/mL混合液，于大鼠左足底皮下按0.1 mL/足注射，尾根部多點注射0.1 mL/只，防止局部壞死。初次免疫后第8天尾根部注射抗原（0.1 mL/只）加強免疫1次。正常組大鼠左足皮下注射等體積的0.9%氯化鈉溶液。

1.3 干預方法 正常組：常規飼養，自由飲水，不做任何處理；模型組：蒸餾水2 mL（/kg·d）灌胃；雷公藤組：雷公藤多苷片6.25 mg（/kg·d）灌胃；芍甘附子湯組：芍甘附子湯加味12.5 g（/kg·d）灌胃（依據人與動物體表面積換算的等效劑量）。各給藥組均在造模成功后開始灌胃給藥。

1.4 蘇木精-伊紅（HE）染色 灌胃結束后處死大鼠，取后右足踝關節去除皮膚和肌肉，10%中性甲醛溶液固定24 h，12.5%乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）室溫中脫鈣，2 d換1次脫鈣液，30 d關節基本軟化后切片，HE染色，干燥并封片，顯微鏡下觀察脫鈣后關節滑膜組織病理變化。

1.5 標本采集及檢測 灌胃結束后，大鼠麻醉并腹主動脈取血，先以普通采血管取2 mL，室溫靜置1 h后，以3 000 r/min離心15 min，離心半徑為60 mm，分離血清，分裝于1.5 mL離心管中。ELISA法檢測大鼠血清IL-2、IL-17A及TNF-α水平，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.6 統計學方法 數據用SPSS 23.0統計軟件進行分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果及分析

2.1 HE染色 正常組踝關節組織結構正常，關節軟骨表面光滑，未見滑膜組織增生及炎性細胞浸潤。模型組關節腔明顯狹窄，滑膜組織重度增生，局部壞死脫落，血管翳形成，關節軟骨破壞明顯。雷公藤組關節腔局部略狹窄，關節面大部分光滑，局部軟骨脫落，滑膜組織輕微增生。芍甘附子湯組關節腔未見明顯狹窄，關節軟骨表面光滑，局部滑膜組織輕微增生。見圖1。

圖1 踝關節整體觀（×100）

正常組滑膜細胞1～2層，未見滑膜細胞增生及炎細胞浸潤。模型組滑膜組織明顯增厚，局部壞死脫落，大量滑膜細胞增生及炎性細胞浸潤。雷公藤組可見局部滑膜組織膠原纖維增生，未見明顯炎性細胞浸潤，關節面局部血管翳侵入。芍甘附子湯組可見局部滑膜組織增生，未見明顯炎性細胞浸潤。見圖2。

2.2 血清IL-2、IL-17A及TNF-α水平 與正常組比較，模型組IL-2水平增高（P＜0.01），與模型組比較，雷公藤組及芍甘附子湯組IL-2水平下降（P＜0.01），芍甘附子湯組與雷公藤組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。模型組IL-17A水平較正常組增加（P＜0.01），與模型組比較，雷公藤組及芍甘附子湯組IL-17A水平下降（P＜0.01），芍甘附子湯組與雷公藤組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。與正常組比較，模型組TNF-α水平增高（P＜0.05），與模型組比較，雷公藤組TNF-α水平有下降趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05），芍甘附子湯組含量下降（P＜0.01），芍甘附子湯組與雷公藤組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。見表 1。

表1 各組大鼠血清IL-2、IL-17A及 TNF-α 水平（±s） ng/mL

表1 各組大鼠血清IL-2、IL-17A及 TNF-α 水平（±s） ng/mL

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01；與雷公藤組比較，△P＜0.01。

組別 動物數 IL-2 IL-17A TNF-α正常組 6 6.922±1.744 0.068±0.002 0.989±0.007模型組 6 9.478±2.195**0.081±0.010**1.054±0.044*雷公藤組 6 4.144±0.772# 0.063±0.008# 1.012±0.046芍甘附子湯組 6 4.867±0.869# 0.058±0.008# 0.917±0.014#△

3 討論

RA屬于自身免疫性疾病，其病理表現為關節滑膜的慢性炎癥、血管翳形成，并出現關節的軟骨和骨破壞，最終可導致關節畸形和功能喪失。RA的發病機制尚不完全清楚，實驗動物模型仍是RA疾病研究的重要載體[6]。CIA模型在臨床癥狀、病理學改變、免疫反應等方面都與人類RA特征高度相似，故CIA模型仍是目前公認的最佳RA動物模型[7]，被廣泛用于研究疾病發病機制和驗證治療靶點[8]。

多種細胞因子均與RA發病密切相關[9]，其中，TNF-α在活動性RA中參與多種致病機制，導致滑膜組織的炎癥增生、骨和軟骨的破壞、自身免疫反應和RA并發癥等病理生理過程[10]。Hassan等[11]研究發現RA患者的滑液中存在高濃度的TNF-α，且與骨侵蝕有關。IL-17A是IL-17家族重要成員之一，近年來多項研究發現它在RA的發病與進展中發揮作用[12-13]。IL-2由輔助性T細胞1（Th1）分泌，是激活T細胞、維持T細胞分化和增殖的重要細胞因子，可加重炎癥反應。有研究發現RA患者血清IL-2水平明顯高于對照組，且血清IL-2水平與血漿紅細胞沉降率（ESR）、C反應蛋白（CRP）水平及28處關節疾病活動度（DAS28）評分呈正相關，與RA疾病活動度密切相關[14]。本研究發現，模型組中TNF-α水平升高明顯且HE染色中關節軟骨破壞明顯，血管翳形成，進一步證實了TNF-α參與RA滑膜炎癥形成及對關節軟骨侵蝕的過程，而芍甘附子湯組中TNF-α水平顯著下降，且與雷公藤組相比具有統計學差異（P＜0.01），HE染色結果可見雷公藤組關節腔局部略狹窄，局部關節軟骨脫落，而芍甘附子湯組關節腔未見明顯狹窄，關節軟骨表面平滑，未見關節軟骨脫落。由此可見，芍甘附子湯加味在降低TNF-α水平和抑制關節軟骨破壞方面優于雷公藤組。在RA的發生和發展過程中T淋巴細胞起著關鍵的作用。CD4+/CD8+比值的變化是RA發病及免疫損傷的核心環節，模型組IL-2、IL-17A水平與正常組相比均明顯升高（P＜0.01），與RA的活動呈正相關，提示炎性因子表達升高導致T細胞亞群CD4+/CD8+之間相互抑制的平衡被打破，致使大鼠的細胞免疫功能降低，關節滑膜中淋巴細胞浸潤而發病。本研究發現，芍甘附子湯組可降低IL-2、IL-17A及TNF-α水平，提示芍甘附子湯加味可有效改善關節及滑膜炎癥，并對抑制CIA大鼠關節軟骨破壞有一定的作用。

芍甘附子湯加味是在張仲景《傷寒論》芍甘附子湯的基礎上加入雞血藤、青風藤，常常用于痹證的治療。本課題組前期臨床研究結果顯示，芍甘附子湯加味可改善RA患者關節腫痛、晨僵等癥狀，與西藥聯用，可降低血沉水平。現代藥理學亦證實，本方中單個藥物具有調節免疫、抑制炎癥及抑制滑膜細胞增殖等作用[15-16]。方中附子辛、熱，歸心、腎、脾經，可補火助陽，通脈散寒止痛；白芍酸苦微寒，歸肝、脾經，擅養血斂陰，柔肝止痛，為治療四肢拘攣作痛的常用藥之一；甘草，《注解傷寒論》認為其“益虛補血氣而復脈”，味甘性平，歸心、肺、脾、胃經，可補中堅筋骨，緩急止痛；附子、甘草相配辛甘化陽，白芍、甘草相伍酸甘化陰，在此基礎上加用雞血藤、青風藤以行血補血、舒筋活絡、祛風濕，與附子配伍以達溫陽通絡之效。5藥相合，邪正兼顧，標本同治，共奏扶助正氣、調和陰陽、除濕散寒、化瘀通絡之功。雷公藤多苷片為治療RA的二線常用藥物之一，其治療RA療效顯著。研究表明，雷公藤多苷片治療RA發揮抗炎作用與降低血中前列腺素E2（PGE2）、TNF-α和IL-2等因子的產生和釋放有關[17]。本實驗所使用的中藥方劑為復方，各藥物之間通過君臣佐使配伍發揮協同作用，可作用于多個靶點發揮抑制滑膜炎癥和保護關節軟骨的作用。本研究選擇雷公藤多苷片作為陽性對照藥，初步探究其與本方藥在治療RA效果的差異，芍甘附子湯組中TNF-α水平顯著下降，且與雷公藤組相比差異具有統計學意義（P＜0.01），提示芍甘附子湯加味在降低TNF-α水平方面優于雷公藤組。

綜上所述，芍甘附子湯加味可改善CIA大鼠關節滑膜炎癥，保護關節軟骨，降低血清IL-2、IL-17A及TNF-α表達水平，本研究結果為芍甘附子湯加味干預RA提供一定的實驗依據。同時，本研究亦存在一定不足，如芍甘附子湯組和雷公藤組相比，IL-2和IL-17A水平差異無統計學意義，將增加芍甘附子湯高、中、低劑量組，進一步分析兩組之間的差異及降低炎性細胞水平與劑量依賴的相關性，并開展細胞實驗研究，進一步豐富本方藥治療RA的生物學依據。