基于UPLC-Q-TOF-MS/MS分析藜蘆中化學成分*

賈曉華 ，王維 ，高夢園 ，歐陽慧子 ，何俊

（1.天津中醫藥大學，天津市現代中藥重點實驗室，天津 301617；2.天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300193）

藜蘆為百合科植物黑藜蘆（Veratrum nigrum L.）的干燥根及根莖[1]，味苦且辛，性平，有毒，具有催吐、瀉下、祛痰、殺蟲等功效，主產于中國貴州、河南、河北、山東、山西、陜西、甘肅、內蒙古自治區、湖北、四川和東北等地[2-3]。

藜蘆中化學成分復雜，包括生物堿類、黃酮類、二萜類、茋類等[4]，其中藜蘆甾體生物堿在藜蘆中數量最多，含量最高，為主要成分。據文獻報道，藜蘆生物堿既是其有毒成分也是有效成分，它可造成小鼠腦部脫氧核糖核酸（DNA）損傷[5]，引起急性毒性并作用于中樞神經系統[6]，但也具有降低血壓、強心、抗真菌、抗血栓、抗氧化等藥理作用[7]。鑒于其良好的藥理作用，藜蘆在食品添加劑、保健品、醫藥和化妝品等領域的應用也越發廣泛[8]。目前對藜蘆的研究主要集中在化學成分分離和藥理作用等方面[8]，對藜蘆藥材中化學成分分析研究較少[9]。

超高效液相色譜-飛行時間質譜聯用技術（UPLC-Q-TOF-MS/MS）具有高靈敏度、高選擇性、高精密度、高信息采集速度等特點，已成為研究中藥復雜化學成分及其定性分析的重要工具[10]。本研究采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術對藜蘆中的化學成分進行定性分析，通過與Metlin數據庫及對照品比對，結合化合物準分子離子、碎片離子峰信息及相關文獻，共初步鑒定出47個化學成分，為研究藜蘆的有效成分及完善其質量標準提供了理論依據。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1290超高效液相色譜儀（美國Agilent公司），AgilentQ-TOF 6520質譜儀（美國Agilent公司），Agilent MassHunter分析軟件（美國Agilent公司），Milli-Q IQ 7005超純水制備儀（Millipore公司），5424R型高速離心機（德國Eppendorf公司），AS 60/220.R2型十萬分之一天平（波蘭RADWAG公司），G3KT18273型旋渦混合器（賽默飛世爾科技公司）。

1.2 試藥 對照品：環巴胺（批號：DST190314-087）、芥芬胺（批號：DST190407-087）、藜蘆胺（批號：DST190108-024）、槲皮素（批號：DST180521-028）、白藜蘆醇（批號：DST190311-045）、藜蘆定（批號：2-ALI-112-1）均購自成都曼斯特生物科技有限公司，藜蘆托素（批號：CHB-L-153）購自成都克洛瑪生物科技有限公司。甲酸（色譜純）購自美國ROE公司，乙腈（色譜級）、甲醇（色譜級）均購自Merck公司（美國）。藜蘆藥材，購自安徽亳州藥材市場，經天津中醫藥大學李天祥教授鑒定為百合科植物黑藜蘆（Veratrum nigrum L.）的干燥根。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱：CORTECS UPLC C18柱（2.1mm×100mm，1.6μm）；流動相：A相0.1%甲酸水，B相乙腈；梯度洗脫，洗脫梯度為：0～16min，5%～26%B；16～19 min，26%～27%B；19～33 min，27%～42.5%B；33～37 min，42.5%～60%B；37～40 min，60%～70%B；40～42 min，70%～85%B；42～45 min，85%～95%B；流速：0.3 mL/min；進樣體積：3 μL；柱溫：40 ℃。

2.2 質譜條件 離子源為電噴霧離子源，正、負離子模式監測；毛細管溫度350°C；霧化器壓力40 psi；碰撞能量30 V；干燥氣流速11 L/min；碎裂電壓135 V。

2.3 對照品溶液制備 精密稱取對照品藜蘆托素、芥芬胺、環巴胺、藜蘆胺、槲皮素、白藜蘆醇、藜蘆定各1 mg加甲醇定容至10 mL，配制成100 μg/mL的對照品溶液。將對照品溶液均置于4℃冰箱儲存備用。

2.4 供試品溶液的制備 將藜蘆粉碎過2號篩，稱取10 g藜蘆粗粉，加入150 mL 70%乙醇，回流提取3次，每次2 h，合并濾液，放置室溫，補足失重量。取上清液用0.45 μm有機微孔濾膜過濾即得，將儲備液放在4°C冰箱儲存備用。

3 結果與分析

將藜蘆供試品溶液和混合對照品溶液按“2.1”和“2.2”項下的色譜和質譜條件進行UPLC-QTOF-MS/MS分析，分別采集正、負離子模式下的基峰離子流色譜（BPC）圖，見圖1。用Agilent Masshunter Qualitative Analysis分析軟件對正、負離子模式下采集的藜蘆提取物BPC圖進行提取，根據分子離子碎片，確定化合物的分子量和分子式，并對比對照品、文獻及Metlin數據庫進行鑒定。見表1。

表1 藜蘆中化學成分UPLC-Q-TOF-MS/MS鑒別分析

圖1 藜蘆提取物中正、負離子模式下BPC圖

3.1 生物堿類化合物 西藜蘆堿型甾體生物堿是藜蘆中數量最多、含量最高的一類甾體生物堿[4]。該類化合物在電噴霧離子阱質譜（ESI-MS）正模式下顯示明顯的[M+H]+峰，且均出現脫去中性分子氧化氫（H2O）、藜蘆酸（C9H10O4）等的碎片離子信號。以化合物20、36、43說明鑒定過程。

化合物 20[保留時間（tR）=11.97 min]在正離子模式下準分子離子峰m/z 636.346 5[M+H]+，二級質譜中主要碎片離子峰有m/z 618.327 3[M+H-H2O]+、m/z 558.306 3[M+H-H2O-C2H4O2]+、m/z 438.257 3[M+H-2H2O-C2H4O2-C5H10O2]+，可發現該化合物的質譜裂解規律與計莫亭堿參考文獻報道一致[4]，故推測化合物20為計莫亭堿。計莫亭堿的裂解途徑見圖2。

圖2 計莫亭堿裂解途徑

化合物36（tR=18.055 min）在正離子模式下準分子離子峰m/z 658.367 6[M+H]+，二級質譜中主要碎片離子峰有m/z 640.348 4[M+H-H2O]+、m/z 622.337 2[M+H-2H2O]+、m/z 422.270 7[M+H-3H2O-C9H10O4]+、m/z 458.289 8[M+H-H2O-C9H10O4]+，可發現該化合物的質譜裂解規律與藜蘆酰棋盤花胺參考文獻報道一致[4]，故推測化合物36為藜蘆酰棋盤花胺。藜蘆酰棋盤花胺的裂解途徑見圖3。

圖3 藜蘆酰棋盤花胺裂解途徑

化合物43（tR=25.83 min）在正離子模式下準分子離子峰m/z 800.422 6[M+H]+，二級質譜中主要碎片離子峰有m/z 740.401 4[M+H-CH3COOH]+、m/z 540.340 1[M+H-H2O-C9H10O4]+，可發現該化合物的質譜裂解規律與verussurine參考文獻報道一致[4]，故推測化合物43為verussurine。verussurine的裂解途徑見圖4。

圖4 verussurine裂解途徑

3.2 黃酮類化合物 從藜蘆提取物中共鑒定出5個黃酮類成分，黃酮及其苷類在裂解過程中容易發生糖苷鍵斷裂、黃酮苷元C環的逆狄爾斯-阿爾德（RDA）裂解以及一氧化碳（CO）、二氧化碳（CO2）、H2O等一些中性分子的丟失，以化合物3、27為例說明鑒定過程。

化合物3（tR=0.8 min）在負離子模式下準分子離子峰m/z 607.224 3[M-H]－，二級質譜中主要碎片離子峰有 m/z 298.112 8[M-H-C11H18O9-CH3]－，可發現該化合物的質譜裂解規律與葛花苷參考文獻報道一致[13]，故推測化合物3為葛花苷。葛花苷的裂解途徑見圖5。

圖5 葛花苷裂解途徑

化合物27（tR=14.433 min）在負離子模式下一級質譜生成準分子離子峰m/z 269.046 4[M-H]－，二級碎片主要包括 m/z 241.050 9[M-H-CO]－、m/z 197.060 1[M-H-CO-CO2]－，與文獻報道一致[28]，故推測化合物27為去甲漢黃芩素。去甲漢黃芩素的裂解途徑見圖6。

圖6 去甲漢黃芩素裂解途徑

3.3 有機酸類化合物 有機酸類化合物在負離子模式下響應較好，由于該類化合物中含有羧基基團，因此其分子離子峰在裂解過程中存在CO2（44 Da）的中性丟失，以化合物1、4為例說明鑒定過程。

化合物1（tR=0.799 min）在負離子模式下準分子離子峰m/z 179.054 7[M-H]－，二級質譜中主要碎片為 m/z 135.029 1[M-H-CO2]－與文獻報道一致[10]，故推測化合物1為咖啡酸。咖啡酸的裂解途徑見圖7。

圖7 咖啡酸裂解途徑

化合物4（tR=0.9 min）在負離子模式下準分子離子峰m/z 133.013 7[M-H]－，二級質譜中主要碎片離子峰有m/z 115.003 6[M-H-H2O]－，可發現該化合物的質譜裂解規律與蘋果酸參考文獻報道一致[14]，故推測化合物4為蘋果酸。蘋果酸的裂解途徑見圖8。

圖8 蘋果酸裂解途徑

3.4 其他類化合物 除上述3類化合物外，在藜蘆藥材供試品溶液中鑒定出1種香豆素類化合物，由于呋喃香豆素的結構特點，比較容易連續失去中性分子CO和CO2。在正離子模式下，保留時間為9.278 min，獲得 m/z 229.085 8[M+H]+的質譜信號，二級質譜出現201.033 4[M+H-CO]+和185.113 8[M+HCO2]+離子碎片，根據數據庫匹配出分子式為C14H12O3，推測該化合物為川白芷素。

4 討論

藜蘆藥材中化學成分復雜，為得到分離度更好、更豐富的色譜峰，本研究對分析條件進行了多重優化。考察了甲醇-水、乙腈-水兩種不同的流動相系統，結果顯示乙腈-水的洗脫效果優于甲醇-水且分析時間更短，另加入0.1%甲酸后可以改善色譜峰拖尾現象，故流動相采用0.1%甲酸-水和乙腈。同時，考慮到不同化合物響應模式不同，故采用正、負兩種監測模式，實現對大多數化學成分的鑒定。

UPLC-Q-TOF-MS/MS技術具有準確、快速、靈敏的特點，為全面系統研究中藥成分提供了有效途徑。本研究采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術分析了藜蘆中的化學成分，并根據保留時間、相對分子質量、碎片離子等信息，結合對照品的裂解規律并參考相關文獻，成功地鑒定和推測出了藜蘆中的47個化合物，其中包括生物堿類36個、黃酮類5個、有機酸類4個、其他類2個。本研究建立了一種能夠快速準確地鑒定藜蘆藥材中多種化學成分的方法，為藜蘆質量評價指標的選擇及藥效物質基礎的深入研究提供了參考。