內生真菌對宿主植物生長和次級代謝產物影響研究進展*

劉圣越 ，王躍飛 ，何永志 ，李霖 ，房士明 ，張晗

（1.天津中醫藥大學中醫藥研究院，天津 301617；2.天津中醫藥大學制藥工程學院，天津 301617）

內生真菌是指一類存在于健康植物內部各個組織及細胞內，且不會對植物引起明顯病害癥狀的微生物[1]。已經報道的內生真菌都屬于子囊菌類，廣泛分布于苔蘚、蕨類、灌木、藻類、草本及被子與裸子植物。在長期發展進化的過程中，內生真菌與植物建立了互利共惠的關系。宿主植物能夠提供內生真菌生長所需的營養物質[2-3]。內生真菌通過調節植物激素促進植物生長或者協助植物抵抗干旱、蟲害、病原菌侵害等外界因素的脅迫[4-9]。有研究發現內生真菌通過分泌真菌誘導子來誘導植物產生次級代謝產物，增加次級代謝產物的量，或者自身產生與植物相似的次級代謝產物[10-11]。文章對內生真菌促進植物生長、協助宿主對抗外界因素脅迫和影響植物次級代謝產物的產生和積累3個方面進行總結概括，以期為研究內生真菌對宿主植物作用以及中藥資源研究提供一定參考。

1 內生真菌促進植物生長

光源、碳源、土壤及水對于植物生長至關重要，內生真菌對宿主植物生長也有很大影響。相關研究表明內生真菌主要通過調節吲哚-3-乙酸（IAA）[12]和乙烯[13]等植物激素水平來促進植物種子萌發和植物生長。

1.1 內生真菌調節IAA水平促進植物生長 植物激素IAA是一種生長素，是植物生長和發育關鍵的調節因子，對細胞分裂、生長、衰老發揮著重要作用[14]。植物中合成IAA是通過色氨酸（Trp）依賴性途徑或用Trp非依賴性途徑從頭合成。在Trp依賴性途徑中，Trp轉化成IAA有4種生物合成途徑[15]，而在真菌中，主要有兩種途徑：一種是通過氨基轉移酶（TAA）將 Trp轉化成吲哚-3-丙酮酸（IPA），然后IPA在黃素單加氧酶（FMO）的作用下轉化成IAA。另一種則是Trp經色氨酸脫羧酶（TDC）形成色胺（TAM），TAM在胺氧化酶（AO）的催化下形成吲哚-3-乙醛（IAAld），后者再經吲哚-3-乙醛脫氫酶（IAD）轉化成IAA[16]。而在Trp非依賴性途徑中，吲哚-3-甘油磷酸作為前體，在吲哚合酶（INS）的作用下形成吲哚，后者再轉化成IAA，但植物吲哚如何轉化成IAA的機制尚不清晰，可能通過吲哚-3-乙腈（IAN）、IPA、吲哚-3-乙酰胺（IAM）等中間體合成IAA[17]。見圖 1。

圖1 真菌中IAA的合成途徑

文獻報道內生真菌可產生IAA從而促進植物種子萌發及根、莖、葉的生長。Chutima等[18]從蘭花根中分離出3種高產IAA的瘤菌根菌屬真菌Tulasnella CMU-SLP 007、Tulasnella CMU-NUT 013和Tulasnella CMU-AU 006，將這3種真菌接種于蕓豆及玉米種子中，發現蕓豆根生長長度增加，促進了玉米種子萌發。內生真菌還通過調控TAA影響IAA的合成。Kulkarni等[19]從種植鷹嘴豆土壤樣品中分離出鐮刀菌屬真菌Fusarium delphinoides，采用氣相色譜分析檢測該菌中存在IPA，并且TAA活性增強，IAA含量增加，促進了鷹嘴豆生長。Kumla等[20]用高效液相色譜（HPLC）法檢測出6種真菌的粗酶提取物中都有IPA，且這些真菌中的TAA活性均增強。同時在接種這6種真菌的燕麥中發現這些真菌均能產生IAA，促進燕麥胚芽鞘伸長。有研究顯示內生真菌還能通過調控色胺途徑中IAD促進植物生長。Reineke等[21]將敲除IAD基因的黑粉菌屬真菌Ustilago maydis突變體接種于玉米，顯示IAAld向IAA轉化過程受阻，而具有IAD基因的原始菌株能產生較高水平的IAA，從而促進玉米生長。內生真菌不僅能通過Trp依賴性途徑合成IAA，還能通過Trp非依賴性途徑合成IAA。Khan等[22]使用液相色譜-串聯質譜（LC-MS）法對從乳香樹中分離出的短梗霉屬真菌Aureobasidium sp.BSS6菌株培養濾液中的IAA進行分析，發現其培養濾液中存在吲哚-3-甘油磷酸而無Trp，并且該菌株顯示較高的IAA合成，促進了乳香樹生長。強曉晶[23]分析從披堿草種子中篩選出的3種鏈格孢屬真菌Alternaria sp.LQ1230、Alternaria sp.LQ2、Alternaria sp.LQ141 的純培養濾液，發現這3種菌株內無Trp存在，但這3種真菌仍能產生IAA，將這3種真菌接種于小麥幼苗中，均能顯著促進小麥生長。上述文獻研究表明內生真菌能通過Trp依賴途徑和非Trp依賴途徑合成IAA，并且自身調控這兩種途徑中涉及的中間產物及酶，增加植物IAA水平，進而促進植物根、莖、葉的生長及果實成熟。

1.2 內生真菌通過降低乙烯水平刺激植物生長 乙烯是一種有生物活性的氣體分子，低濃度乙烯能促進植物生長，而高濃度乙烯則會抑制其生長，因此降低乙烯水平有助于植物生長發育、果實成熟及延緩組織衰老等[24]。在乙烯的生物合成途徑中，甲硫氨酸在S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAMS）的作用下形成S-腺苷甲硫氨酸（SAM），SAM在氨基環丙烷羧酸合酶的催化下合成氨基環丙烷羧（ACC），后者在氨基環丙烷羧氧化酶作用下進一步合成乙烯[25]。其中ACC是合成乙烯的重要前體物質。見圖2。

圖2 乙烯的合成途徑

內生真菌可產生1-氨基環丙烷-1-羧酸脫氨酶（ACCD），該酶能將乙烯合成途徑中的前體物質ACC裂解成α-酮丁酸和氨，從而減少乙烯的合成，刺激植物的生長。Zhang等[26]檢測到含有木霉屬真菌Trichoderma asperellum ACCC30536的擬南芥中ACCD活性增強，擬南芥中乙烯含量降低，根長、根數、鮮質量、種子等生長參數均增加。此外Zhang等[27]還檢測到含有木霉屬真菌Trichoderma asperellum ACCC30536的楊樹幼苗中ACCD活性增強，發現其中乙烯含量降低，促進了楊樹幼苗的生長。Jolanta等[28]發現定殖了木霉屬真菌Trichoderma DEMTkZ3A0的小麥幼苗根部重量增加，在小麥幼苗的根部檢測到ACCD增加，乙烯含量減少，促進小麥幼苗生長。綜上所述，內生真菌可以產生ACCD，該酶降解乙烯合成的前體物質ACC，從而降低植物中乙烯的濃度，達到促進植物生長的作用。

2 內生真菌激活植物防御系統對抗惡劣環境

植物在生長過程中會受到干旱、高鹽、重金屬及病原體等帶來的侵害，如干旱能降低種子發芽率、導致葉片氣孔開放減少、植物光合作用受到抑制以及增加植物中的活性氧含量[29-30]。重金屬會破壞土壤質量，并且損害植物細胞的結構，影響植物的生長和代謝[31]。高鹽會使植物中養分失衡，導致特定的離子毒性，同時也會產生大量的活性氧使得植物細胞受損[32]。然而植物中的內生真菌能協助植物對抗脅迫，內生真菌通過調控植物激素的水平，如調控赤霉素（GA）[33]、水楊酸（SA）[34]和茉莉酸（JA）[35]等物質的水平，協助植物對抗環境脅迫。此外，內生真菌還能調節活性氧協助植物對抗惡劣環境[36]。

2.1 內生真菌產生GA誘導植物適應脅迫 GA是一種植物激素，能抵御干旱、鹽等各種脅迫[37-39]。GA主要由前體物質牻牛兒牻牛兒基焦磷酸（GGDP）在古巴焦磷酸合成酶（CPS）和內根-貝殼杉烯合成酶（KS）的催化下形成內根-貝殼杉烯，進而經內根-貝殼杉烯氧化酶（KO）的催化下依次形成內根-貝殼杉烯醇、內根-貝殼杉烯醛和內根-貝殼杉烯酸（KA）。KA則在內根-貝殼杉烯酸氧化酶（KAO）的作用下合成GA12-醛，后者進一步轉化成中間產物GA12。GA12在GA13氧化酶的催化下形成GA53，GA53在 GA20-oxidase、GA3-oxidase和 GA2-oxidase氧化酶的催化下形成不同種類的GA[40]。見圖3。

圖3 GA的合成途徑

內生真菌通過合成GA可提高植物中GA水平，從而協助植物對抗環境脅迫。Khan等[41]將從黃瓜植株中分離得到的擬青霉菌屬真菌Paecilomyces formosus LHL10接種于處于鹽脅迫下的宿主植物中，并與未接種菌株的植物相比較，結果顯示接種菌株的植物中GA分子GA20合成增加，GA含量顯著增高，減弱了宿主植物受到的鹽脅迫。Cosme等[42]將梨形孢屬真菌印度梨形孢Piriformospora indica接種于含有稻水象甲的水稻中，與未接種內生真菌的水稻比較，發現在接種內生真菌的水稻中KS的基因表達和GA含量高于未接種內生真菌的水稻，并且可以抵御稻水象甲的侵害。Bilal等[43]將擬青霉菌屬真菌Paecilomyces formosus LHL10接種于處于鎳脅迫下的大豆植物，結果發現接種該菌減弱了大豆植物的鎳脅迫，并且通過實時熒光聚合酶鏈式反應（RT-PCR）分析發現該真菌內GA合成過程中GA20-oxidase基因上調，大豆植物中GA含量增加。上述文獻結果表明，植物在遭遇外在環境脅迫時，其內生真菌可以調控GA合成過程中的酶來合成GA，提高植物體內GA水平，進而幫助植物抵御脅迫。

2.2 內生真菌通過調控SA和JA抵御環境脅迫 SA和JA是高等植物的內源性調節物質，可以促進植物對病原體的抵御。SA的合成途徑是苯丙氨酸先轉化成肉桂酸（t-CA），t-CA經苯丙氨酸解氨酶（PAL）催化形成苯甲酸，苯甲酸在苯甲酸2-羥化酶（BA2H）作用下經羥基化形成SA，其中PAL是其合成過程中的關鍵酶。見圖4。

圖4 SA的合成途徑

JA則是α-亞麻酸在13-脂氧合酶（LOX）的作用下氧化成13-氫過氧-亞麻酸，再由13-氫過氧化物脫水酶催化成12-13環氧亞麻酸，并由13-氫過氧化物環化酶催化成12-氧-植物二烯酸，此物質再由12-氧-植物二烯酸還原酶催化成3-氧-2-（2-戊烯基）-環戊烷辛酸，再由β氧化生成JA。其中LOX是JA合成過程中的關鍵酶[44-45]。見圖5。

圖5 JA的合成途徑

植物經常會受到蟲害、病原菌及機械創傷造成的侵害，而內生真菌能調控SA和JA的水平誘導其宿主植物對抗這些侵害。馬碧花等[46]從蘭州大學草地農業科學院采摘帶內生真菌和不帶內生真菌的多年生黑麥草，賦予這兩種黑麥草干旱脅迫，兩者相比較，帶內生真菌的黑麥草枝葉茂盛，而不帶內生真菌的黑麥草枝葉凋落。經檢測帶有內生真菌的黑麥草相對含水量、葉綠素含量和SA含量高于不帶內生真菌的黑麥草。Mishra等[47]將鏈格孢菌屬真菌Alternaria alternata接種于宿主植物并給予其病原體侵害，與未接種內生真菌的宿主植物相比，其SA合成過程中PAL基因上調，植物中SA含量增加，宿主植物受到病原體的傷害減弱。Pappas等[48]將鐮刀菌屬真菌Fusarium solani接種于番茄中，給予葉螨侵染，結果發現與未接種該菌的番茄相比，番茄中葉螨的產卵下降，并且發現LOX基因的表達增強，番茄中JA含量增加。綜上所述，內生真菌調控植物中SA和JA的含量，協助宿主植物對抗病原體的進攻。

2.3 內生真菌調控活性氧對抗脅迫 活性氧是指機體內或者自然環境中由氧組成，并且性質活潑的物質總稱，包括超氧陰離子、過氧化氫（H2O2）及氧氣，也是體內正常代謝的副產物。當植物長期暴露于干旱、高鹽、病原體感染等環境時，這些環境會迫使植物產生活性氧，而過量的活性氧則會造成蛋白質和植物細胞氧化受損[49]。

NADPH氧化酶（NoxA）是活性氧形成過程中的關鍵酶，電子供體NADPH轉移的電子通過黃細胞色素B558轉至細胞膜的胞質側，這些電子與電子受體反應并產生超氧化物，進而產生大量的活性氧[50]。內生真菌能調節植物體內的抗氧化酶，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）來抑制NADPH氧化酶活性，協助植物清除活性氧進而減少細胞受損[51]。張詩婉[52]從盤錦紅海灘堿蓬Suaeda glauca Bunge葉片中分離出內生真菌Y1-1，將其接種于重金屬鎘感染的水稻幼苗中，與未接種真菌的水稻幼苗比較，有效緩解了水稻幼苗受到的鎘侵害，經檢測發現接種真菌的水稻幼苗中SOD、CAT、POD等抗氧化酶活性增加，使得處于干旱脅迫下的水稻中的鎘含量和活性氧減少。胡桂馨等[53]將頂頭胞霉菌Acremonium coenophialum接種于高羊茅中，置于干旱環境下，與未接種的高羊茅相比，接種內生真菌的高羊茅中SOD、CAT等抗氧化酶活性和相對含水量均高于未接種的高羊茅。張永雯[54]將細交鏈孢菌Alternaria alternata、根腐離蠕孢Bipolaris sorokiniana和燕麥鐮刀菌Fusarium avenaceum接種于鹽脅迫下的野大麥，發現野大麥中POD、CAT、SOD酶活性增強，活性氧的含量降低。上述研究表明，內生真菌能增強抗氧化酶活性來抑制活性氧形成過程中的NADPH氧化酶，維持植物中活性氧與抗氧化性的平衡，進而協助植物對抗環境脅迫。

3 增加宿主次級代謝物質積累

植物次級代謝產物對人類健康有著重要影響，但是植物次級代謝產物的獲取受植物生長周期限制，而且有些成分含量極低。植物內生真菌不僅能通過自身產生誘導物質促進植物次級代謝產物的生物合成[55-56]，而且還能產生與宿主植物相似的次級代謝產物[57-61]。

3.1 內生真菌通過真菌誘導子刺激宿主次級代謝物質積累 刺激次級代謝產物產生的分子稱為誘導子，而誘導則是增加植物中次級代謝產物產生的有效手段之一。內生真菌中的誘導子如寡糖、多糖、甘露聚糖及植物激素可以活化植物中特定的某類次級代謝產物的代謝途徑，進而調控這類物質的生物合成。Li等[62]從鐮刀菌屬真菌Fzarium oxysporum Dzf17的菌絲體中制備寡糖，將其加入盾葉薯中，發現薯蕷皂苷元含量增大。Zhong等[63]將鐮刀菌屬真菌Fusarium oxysporum Fat9中的胞外多糖加入苦蕎麥中，發現苦蕎麥芽中蘆丁和槲皮素的總產量增加。Chen等[64]從孔球孢霉屬真菌Gilmaniella sp.AL12中提取出胞外甘露聚糖，將其加入到蒼術中，顯示部分甘露聚糖被降解為甘露糖，并被己糖激酶活化，促進了光合作用、能量代謝及萜類化合物的生成。Jie等[65]研究發現內生真菌Gilmaniella sp.AL12能誘導白術中的乙烯生成，并且刺激H2O2和一氧化氮（NO）的信號通路轉導，從而刺激白術中倍半萜類化合物的合成。Ren等[66]先用JA抑制劑布洛芬（IBU）和去甲二氫愈創木酸處理白術，抑制了白術中JA和揮發油的產生，隨后將內生真菌孔球孢霉Gilmaniella sp.AL12接種于白術中，經檢測發現白術中JA含量增加，同時增加了白術中的揮發油含量。上述研究結果說明內生真菌能通過各種真菌誘導子刺激植物產生次級代謝產物，增加其積累。

3.2 內生真菌產生與其宿主相同或相似的代謝產物 內生真菌不僅能刺激植物產生次級代謝產物積累，由于與宿主共同進化還可能會產生與其宿主相同或相似的代謝產物。其原因是植物代謝過程中某些關鍵酶的基因垂直傳遞給內生真菌，導致真菌產生與植物相同或類似的代謝產物[67]。Strobel等[68]從西藏紅豆杉中分離出1株擬盤多毛孢屬真菌Pestalotiopsis microspora，從該菌的提取物中分離出一種與紫杉醇類似的化合物，通過進一步的LC-MS和核磁共振（NMR）分析，并與對照品紫杉醇比對，證實該化合物為紫杉醇。張春燕[69]從構樹[Broussonetia papyrifera（L.）Vent]中分離出 48 株內生真菌，其中兩株真菌Chaetomium globousm和Alternaria sp產生與構樹相似的生物堿類化合物。厲秀秀等[70]從黃連中分離得到12株內生真菌，其中1株擬莖點霉屬內生真菌Phomopsis HL-BC，經HPLC檢測，該內生真菌的發酵液中含有小檗堿。袁麗紅等[71]從盾葉薯蕷根狀莖中分離出1株盤針孢菌屬內生真菌Libertella sp.RE0105，發現其能產生與盾葉薯蕷相同的代謝產物——薯蕷皂苷元。上述研究表明，內生真菌能產生與宿主植物相同或類似的次級代謝產物，可從內生真菌中獲得與植物相同或類似的代謝產物，具有不受植物資源限制的優勢。

4 結論與展望

藥用植物中的內生真菌種類眾多，資源豐富，是一類尚未充分利用并且應用前景廣闊的微生物。內生真菌可以促進植物生長，協助其宿主植物對抗惡劣環境脅迫，產生與宿主植物相類似的次級代謝產物及誘導植物次級代謝產物積累。因此對內生真菌進行全面深入的研究有助于植物的開發與保護，并且產生具有良好生物活性的成分。在現階段研究中，關于植物通過什么路徑將其代謝過程中的關鍵酶基因傳遞給內生真菌有待進一步研究。一些珍貴稀少的植物還未展開內生真菌的研究。目前對于內生真菌的研究還處于實驗室中，尚未進行大規模的工業生產。因此對于藥用植物中內生真菌的研究還有待進一步深化，應該利用現代生物技術進行更深層次的機制研究，闡明內生真菌與宿主植物之間的關系，有利于保護珍稀、瀕危的藥用植物，大規模分離內生真菌，尋找新穎的活性先導化合物，為新藥研發奠定基礎。