細菌光修復實驗的設計和改進

呂 俊，施 浩，陳思夢，孟 宇，徐 蕾

DNA 是包括人體在內絕大多數生物體的遺傳物質，其穩定性是遺傳保守性的基礎.然而，多種因素可能導致DNA 出現損傷，進而影響遺傳信息的表達和傳遞，導致細胞生長停滯、衰老、死亡，使機體引起炎癥、甚至腫瘤等多種疾病.DNA 損傷的修復，是生物體維持DNA 正常結構，保持細胞正常功能，防止一系列疾病發生的重要手段［1-2］.由于DNA 修復的重要性，該領域的研究日益受到人們的關注.2015 年，科學家托馬斯·林達爾、保羅·莫德里克、阿齊茲·桑賈爾被授予諾貝爾化學獎，以表彰他們在DNA 修復方面的卓越研究成果［3-5］.目前，在本科生物化學課程的理論教學中，DNA 的損傷和修復內容已單獨列為一個章節進行講解［6］.然而，關于DNA 損傷和修復的實驗教學，目前尚屬于空白.這使得學生在學習相關知識的過程中，出現理論和實踐的脫節，難以深入掌握相關知識點.設計切實可行的相關教學實驗，是生物化學教學中亟待解決的課題.

中短波紫外線（波長200 nm～315 nm）可導致DNA 鏈上相鄰的嘧啶堿基發生共價交聯，形成嘧啶二聚體損傷.很多生物體存在光修復酶（photolyase），可吸收利用波長為315 nm～500 nm 的長波紫外線和可見光的能量，直接修復紫外線造成的嘧啶二聚體損傷，此過程稱為光修復，也是阿齊茲·桑賈爾獲諾貝爾獎的研究內容之一［7］.我們以光修復現象為出發點，設計了細菌的光修復實驗，并對實驗進行了合理改進，使實驗更加便捷、高效，以適合本科實驗教學的需要.同時該實驗方法也適用于光修復的相關科學研究.

1 材料與方法

1.1 器材

超凈工作臺、培養箱、恒溫空氣搖床、臺式離心機、高壓滅菌鍋、-80 ℃冰箱、分光光度計、試管、培養皿、接種環、涂棒、酒精燈、計時器、低壓汞燈（發射波長254 nm）、白色LED 光源、紅色LED 光源（發射波長635 nm）、手術盤蓋、遮光窗簾、微量移液器、紫外護目鏡、防護手套.

1.2 菌株和試劑

菌株為大腸桿菌DH5α，為本實驗室保存.LB 培養基：胰蛋白胨（10 g/L），酵母提取物（5 g/L），NaCl（10 g/L）；固體培養基加1%瓊脂粉，滅菌后倒平板.生理鹽水：0.9% NaCl.化學光 強 計 母 液A 液：Na2B4O7·10H2O 0.38g，KI 9.96 g，定容到50 mL；B 液：KIO32.14 g，定容到50 mL.

1.3 實驗操作

（1）低壓汞燈紫外光強的測量.方法根據文獻［8］改編.取化學光強計母液A 液和B 液各2.5 mL 混合，加入敞口的培養皿（直徑7 cm），置于低壓汞燈垂直下方50 cm 處，用手術盤蓋住.打開低壓汞燈預熱5 min，其間操作者戴好紫外護目鏡和防護手套.揭開手術盤，同時計時光照.計時結束同時將手術盤蓋上，關燈，取少量樣品稀釋10 倍后檢測352 nm 吸光度變化.重復若干次，記錄光照時間和352 nm吸光度，并作圖分析計算光強.

（2）細菌培養和菌落計數.取凍存保種菌在LB 固體培養基平板進行劃線培養，37 ℃培養過夜，長出單菌落后，從平板上挑取一個單菌落接于2 mL LB 液體培養基的試管中，37 ℃振蕩培養過夜.取培養好的菌液，用生理鹽水稀釋100 倍，然后以10 倍梯度連續稀釋至10-7倍.取不同稀釋梯度的菌液100 μL 分別在LB固體培養基涂板，同時在LB 固體培養基上按照濃度梯度取5 μL 菌液點板，37 ℃避光培養，隔日對平板上菌落進行計數.做三次平行實驗.

（3）細菌的紫外損傷和光修復實驗.將實驗室的遮光窗簾拉上，創造一個暗環境，照明采用紅色LED 光源，防止不必要的光修復.取100 μL 菌液置于剪下的滅菌EP 管蓋中并將其置于低壓汞燈垂直下方50 cm 處，用手術盤蓋住.打開低壓汞燈預熱5 min，其間操作者戴好紫外護目鏡和防護手套.揭開手術盤同時光照并計時，計時結束同時將手術盤蓋上，關燈.將菌液用生理鹽水按不同濃度梯度稀釋后分別涂板和點板培養，隔日對平板上菌落進行計數.將紫外照射的菌液在暗處孵育10 min 后放置于白色LED 燈垂直下方10 cm處，用手術盤蓋住.打開白色LED 燈，揭開手術盤，同時計時光照.計時結束同時將手術盤蓋上，關燈.將菌液用生理鹽水按不同濃度梯度稀釋后分別涂板和點板，37 ℃避光培養，隔日對平板上菌落進行計數.做三次平行實驗.

將紫外照射后部分損傷的菌液放在暗處孵育0 min、5 min、10 min、20 min、40 min 后開始白色LED 光照并計時，取樣后用生理鹽水按不同濃度梯度稀釋后點板37 ℃避光培養，隔日對平板上菌落進行計數.做三次平行實驗，探究暗處孵育對紫外損傷后的菌液光修復的影響.

2 結果

2.1 化學光強計測量紫外光強

碘化鉀—碘酸鉀化學光強計的原理是碘化鉀和碘酸鉀在光子的催化下，生成I3，產物在352 nm 具有吸收峰，消光系數為27 600 L/（mol·cm），量子產率為0.73.測量紫外吸收光譜時取少量樣品稀釋10 倍測量.根據測量結果作圖分析，計算出紫外光強（圖1）.

圖1 碘化鉀-碘酸鉀化學光強計測量結果

從圖1 可以看出，取352 nm 處的吸光度對紫外光照時間作圖后，經線性擬合R2=0.987，斜率0.068 6，表明紫外光強約為2.11 W/m2.

計算得到352 nm處I3的生成速率為0.119 6，因 此I3的 摩 爾 數=0.005×A352nm/27 600，其 中0.005 是樣品體積（5 mL）除以1 升（1 000 mL）的體積的比值，27 600 是摩爾消光系數.通過光強計算公式I=Nhv/St計算可得本次實驗的光強=2.11 W/m2.其中：v表示光的頻率，S為照射區域面積，N為時間間隔t內照到S上的光子總數，h是普朗克常數.

2.2 細菌的菌落計數——涂板法和點板法的比較

涂板法和點板法所得到的菌落數接近，但點板法和涂板法相比較，所用的培養皿、實驗耗材相對較少，所耗時間也比較少，細菌存活率變化更加直觀，因此我們在后續的試驗中均采用點板法進行.

2.3 細菌的紫外存活率和光修復效率的測定

將紫外照射后的菌液梯度稀釋進行點板培養，隔日進行菌落計數.按照同樣的方法將紫外照射后的菌液置于白色LED 燈下進行光修復.通過作圖測定出細菌的紫外存活率和白光的修復效率.DH5α 紫外光照后的計數結果及DH5α 光修復后的計數結果分別如圖2和圖3 所示.

圖2 DH5α 紫外光照后計數結果

圖3 DH5α 光修復后計數結果

3 討論與結論

低壓汞燈又名紫外滅菌燈，其發射波長為254 nm，正好位于DNA 和蛋白質吸收峰附近，容易造成DNA 等生物大分子損傷.低波長紫外線可引起DNA 同一條鏈上相鄰的嘧啶堿基形成二聚體結構（TT），導致DNA 的雙螺旋結構發生改變，使復制與轉錄過程受阻，從而抑制細菌生長或殺死細菌［9］.在大腸桿菌（DH5α）中存在一種DNA 光修復酶（DNA photolyase），能夠識別并結合損傷的嘧啶二聚體，在可見光（400 nm）激發下，修復紫外造成的DNA 損傷［10-11］.市面的紫外光強計昂貴且準確度低，不適用于本科實驗教學.在紫外損傷細菌實驗中，我們采用了碘化鉀—碘酸鉀化學光強計進行紫外光強的間接測量，科學合理地測量出不同規格的低壓汞燈的紫外劑量，與傳統的草酸鐵鉀光強計［12］相比，其在紫外區準確度更高，且對可見光不敏感，學生能夠高效簡便地重復實驗.

細菌涂板計數法雖然靈敏度高，結果較為準確，但是存在可計數濃度范圍窄、計數準確度低、涂布不均和計數工作量大等問題，容易造成較大的實驗誤差.與涂板計數法［13］相比，點板法具有所需樣品量少、點樣區域小，檢測范圍廣，計數簡便等優點.這種方法不僅可以直觀地反映不同濃度下菌落數的變化，而且可以降低實驗成本，提高實驗效率.為了讓學生更直觀地了解光修復的原理，采用點板法設計細菌紫外損傷和光修復實驗更加合理.在一定范圍內，細菌經過紫外損傷后菌落數逐漸減少，光修復實驗后菌落數逐漸增加，在同一塊培養皿上可以直觀地看出這種變化.此外，在實驗過程中我們采用紅色LED 光源照明，波長（635 nm）較為單一，可以有效防止照明光源對細菌的光修復.

一定量的紫外線照射后的大腸桿菌黑暗條件下被保存在緩沖液或鹽水中時，能夠在復雜培養基上形成菌落的細胞數量逐漸增加［14-15］，這被稱為液體復蘇持有（Liquid holding recovery，LHR）.紫外照射后在黑暗處保存不同的時間開始計時光照，取樣點板，結果顯示，短暫的暗處孵育對細菌的光修復影響并不明顯，考慮到光修復酶與DNA 損傷識別、結合需要一定的時間［16］，實驗采用紫外照射后10 min 開始光照以達到預期實驗結果.結果表明，細菌光修復實驗的設計和改進科學合理，但存在一定的局限性，細菌的種屬、生長狀態等因素對實驗結果有一定的影響，光修復酶的具體作用分子機制尚不清楚，后期將進一步開展不同菌種、實驗條件的細菌光修復實驗，奠定DNA 損傷和修復實驗教學基礎.