基于Nrf2/HO-1 通路比較雷公藤與及己根水提取物對大鼠的腎毒性

夏榮平，孫淑萍，張家豪，李佳榮，曹雯靜，許珊珊，靳珊珊

雷公藤（Tripterygium wilfordiiHook.f.）隸屬于衛矛科雷公藤屬，其去皮后的根入藥可用于治療炎癥性疾病，臨床上常用于濕熱結節、關節炎和跌打損傷等疾病的治療［1］.臨床研究［2-3］表明，患者在服用雷公藤后出現一些明顯的不良反應癥狀.主要特征為：胃腸道反應、谷丙轉氨酶明顯升高（約2 倍）、心血管疾病等.一些女性患者甚至出現了月經紊亂、皮膚粘膜受損、脫發.本課題組前期的研究［4］也證實了雷公藤提取物在一定的劑量范圍內對大鼠腎臟具有明顯毒性作用，故需要嚴格控制其劑量，做好臨床監測工作.

及己（Chloranthus serratus Roem.et Schult）隸屬于金粟蘭科金粟蘭屬，以其具有抗菌消炎、舒筋活絡等作用的根或全草入藥，可以治療風濕疼痛及相關炎癥疾病［5］.及己既可以內服也可以外用，但及己根有毒，過量服用會引起嘔吐、意識模糊、心外膜內出血、肺出血及腎功能損傷等癥，嚴重者會導致死亡［6］.

本課題組前期研究發現，雷公藤和及己均能用于治療炎癥疾病，且都具有一定的腎毒性［4-5］.而目前有關雷公藤、及己的毒性報道多為肝毒性和心臟毒性，對腎毒性方面的研究相對缺乏.因此，本研究選擇了氧化應激損傷和Nrf2/HO-1 信號通路作為雷公藤和及己根水提取物致損傷的切入點來比較兩者引發的大鼠腎毒性大小，從而推斷及己是否有替代雷公藤用于臨床治療的可能，也為后期醫療人員應用及己治療相關炎癥疾病奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

（1）主要儀器.酶標儀（深圳山特電子有限公司）；顯微鏡（CKX3OLYMPUS，昆山諾普森實驗室用品科技有限公司）；電泳儀（Biorad，深圳市宇德立生物科技有限公司）；自動曝光儀（Amersham Imager 600，General Electric Company）；高速冷凍離心機（安徽嘉文儀器裝備有限公司）等.

（2）藥材.試驗藥材均為2013 年購自安徽亳州中藥材市場，符合《中國藥典》2015 版一部質量標準.將中藥及己根與雷公藤清洗干凈，待風干后粉碎成粗粉，室溫干燥保存.定量稱取雷公藤粗粉500 g，回流提取三次：分別用12 倍量水、10 倍量水、8 倍量水，提取1.5 h、1 h、1 h.將濾液合并，濃縮至黏稠狀，然后置于干燥箱（45 ℃），干燥好后粉碎過篩（80目），得雷公藤水提取物（LS）.及己根水提取物（GS）制備方法同上.藥物提取率（%）=水提取物重量（g）/粗粉重量（g）×100%.及己根、雷公藤的藥物提取率分別為14.2%、13.8%.

（3）試劑.尿酸（UA）、肌酐（CR）試劑盒（RCL0248、RCL0246，上海容創生物技術有限公司）；尿素氮（BUN）試劑盒（2014007，長春匯力生物技術有限公司）；總超氧化物歧化酶（T-SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒（20190613、20190616，南京建成生物工程研究所）；核因子E2 相關因子2（Nrf2）一抗（美國Proteintech公司，16396-1-AP）；鼠來源β-actin 一抗（批號：66240-1-LS）、HRP-羊抗鼠IgG（批號：BST12F21C50）、兔來源血紅素加氧酶-1（HO-1）一抗（批號：ZP1039BP39）、HRP-羊抗兔IgG（批號：BST12L05A54）、轉化生長因子TGF-β1一抗（批號：BST12F21C49），均買自武漢BOSTER生物工程有限公司.

（4）實驗動物.30 只SD 雄性大鼠，鼠齡為6 周，體質量為（190±10）g.實驗大鼠采購于山東省實驗動物中心，批號：SCXK（魯）2014-0007.飼養環境：室溫、通風、正常進行飲食，實驗前適應性喂養7 d.

1.2 急性毒性實驗

實驗開始前，分別向兩組大鼠灌胃給予相應濃度的藥物提取物（GS 溶液濃度為38.3 g/kg、LS 溶液濃度為37.3 g/kg）.如果大鼠未出現死亡，則另取2 只灌胃給予GS 溶液，2 只灌胃給予LS 溶液，觀察這些大鼠在48 h 內的總體狀態變化和死亡率.

1.3 實驗分組及給藥

將大鼠按隨機數字表隨機均分為3 組：空白（KB）組、及己根水提取物（GS）組和雷公藤水提取物（LS）組，每組10 只.按照人和動物體表面積比值劑量表［7］和預實驗結果，確定實驗大鼠給藥劑量（提取物質量，g/kg）為：成人給藥劑量3 g（原藥材）×換算系數（0.018）×藥材提取率（GS 提取率為14.2%，LS 提取率為13.8%）×倍數（100）×5；5 為200 g 大鼠用藥量轉化成1 kg 大鼠用藥量，即GS 組為3.83 g/kg、LS 組為3.73 g/kg.每天分別將及己根與雷公藤水提取物灌胃給予GS 組和LS 組大鼠，KB 組給予等量的蒸餾水，持續給藥兩周.

1.4 大鼠日常狀況觀察

每日給藥時通過觀察大鼠的毛色、進食、進水、日常活動及精神等基本狀況，判斷其是否出現毒性癥狀，并從初次給藥之日起，隔日記錄一次各組大鼠的體重，計算出各組大鼠的體重變化率.體重變化率（%）=（實驗開始后某一天的體重-第一天的體重）/第一天的體重×100%.

1.5 樣本的采集和腎功能檢測

給藥 第15 天，按0.4 mL/100 g 的 劑量，用25%烏拉坦溶液腹腔注射，使大鼠麻醉，進行眼球取血.將取好的血液離心15 min（4 ℃、3 000 rpm），取其上清液，按照試劑盒說明書用酶標儀測BUN、CR 和UA 含量.

取血后將大鼠處死并收集腎臟組織，洗凈吸干后稱重，計算腎臟系數.腎臟系數（%）=腎臟質量（g）/大鼠質量（g）×100%.取大鼠左側腎臟組織，用10%甲醛溶液進行固定后使用常規HE 染色并進行病理檢查，其余保存在-80 ℃冰箱.

1.6 大鼠腎臟勻漿中MDA和T-SOD含量測定

取適量保存的腎臟組織復溫，按質量體積比為1∶9 加入冰生理鹽水進行勻漿.于4 ℃、2 500 rpm 下將腎臟組織勻漿液離心20 min.取上清液按相應的試劑盒說明書測定MDA 和T-SOD 含量.

1.7 大鼠腎臟微結構病變觀察

取1.5 中固定的腎臟組織，梯度乙醇進行脫水，用石蠟進行包埋制片（約5 μm）.將制好的切片進行脫蠟、醇化、HE 染色，徹底脫水、透明及封片后于顯微鏡下觀察，以確定是否出現炎性細胞、血管擴張充血和脂肪變性等病理學改變.

1.8 免疫組化法檢測大鼠腎臟中TGF-β1 陽性表達情況

將1.7 中制作的石蠟切片脫蠟、梯度乙醇復水、枸櫞酸熱修復、3% H2O2溶液滅活內源性酶、血清封閉后，進行一抗孵育過夜（4 ℃）和二抗孵育，滴加SABC 和顯色液，復染、封片.顯微鏡下觀察并拍照，選擇具有代表性的免疫組化圖片，采用Image J 軟件讀取三次免疫組化圖片的陽性表達百分率，并用SPSS 23.0軟件對所得結果進行統計分析.

1.9 Western bloting 檢 測Nrf2/HO-1 通 路 蛋白含量

取適量1.5 中的腎臟組織，加入250 μL 裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1），冰水浴研磨勻漿20 min 后離心20 min（4 ℃、12 000 rpm），收集上清液于EP 管中，進行BCA 蛋白含量測定，加入4 倍體積的上樣緩沖液，然后于沸水浴中加熱進行變性.以蛋白含量40 μg/孔，并在12%聚丙烯酰胺凝膠中電泳40 min 后110 V恒壓轉膜（NC 膜）70 min.將NC 膜用5%脫脂牛奶封閉2 h 之后一抗（Nrf2、HO-1、β-tubulin、β-actin）孵育過夜（4 ℃），清洗，孵育二抗2 h后滴加發光液曝光，用Image J 軟件獲取曝光后各條帶的灰度值，并進行統計分析.

1.10 統計學分析

所有數據均用SPSS 23.0 軟件處理，結果以平均值±標準差表示.單因素方差分析用于多組樣本之間均數的比較，采用LSD 進行事后檢驗.P值小于0.05，表示具有顯著性差異.

2 結果

2.1 大鼠急性毒性實驗

GS組和LS組大鼠的用藥量分別為3.83 g/kg和3.73 g/kg 時，不會造成大鼠死亡.同時，實驗結果顯示，GS 組和LS 組大鼠的LD50分別高于3.83 g/kg 和3.73 g/kg.因此，最終選擇GS 組3.83 g/kg 和LS 組3.73 g/kg 作 為 評 估GS、LS 致大鼠腎毒性大小的劑量.

2.2 大鼠日常狀況觀察

KB 組大鼠飲食規律、精神飽滿、毛發光滑有光澤；與KB 組相比，GS 組大鼠飲食、毛發未見明顯異常；LS 組大鼠飲食減少、精神萎靡、大便黏稠、有掉毛現象.

2.3 大鼠體重變化趨勢

從第3 d 到第15 d，KB 組大鼠體重增長率高于GS 組和LS 組，且組間差距從第13 d 開始逐步增大.GS 組大鼠體重增長較平穩，但其體重變化率在實驗后期較KB 組極顯著降低（P<0.01），LS 組體重增長率后期較KB 組和GS 組極顯著降低（P<0.01），見圖1.

圖1 KB、LS、GS 組大鼠體重變化率曲線

2.4 對腎臟系數的影響

與KB 組相比，LS 組能誘導較GS 組更明顯的大鼠腎臟系數的上升（P<0.05），見圖2.

圖2 各組大鼠腎臟系數

2.5 對腎臟MDA 和T-SOD 含量的影響

與KB 組相比，LS 組大鼠T-SOD 含量的降低和MDA 含量的上升均較明顯（P<0.01）；GS組中T-SOD 和MDA 含量均降低，但無統計學意義，見表1.

表1 大鼠腎臟勻漿中T-SOD 和MDA 含量（，n=10）

表1 大鼠腎臟勻漿中T-SOD 和MDA 含量（，n=10）

注：與KB 組相比，**P<0.01；與GS 組相比，##P<0.01.

組別KB LS GS劑量/（g·（kg·d）-1）/3.73 3.83 T-SOD/（U·mgprot-1）119.80±8.96 74.42±4.55**##118.96±5.29 MDA/（nmol·mgprot-1）2.50±0.18 5.78±0.32**##2.48±0.16

2.6 對血清中BUN、CR 和UA 含量的影響

與KB 組相比，LS 組和GS 組的CR 和UA水平均極顯著升高，而BUN 水平僅LS 組升高明顯（P<0.01）；與GS 組相比，LS 組UA 和BUN水平極顯著升高（P<0.01），見表2.

表2 大鼠血清中BUN、CR 和UA 的含量（，n=10）

表2 大鼠血清中BUN、CR 和UA 的含量（，n=10）

注：與KB 組相比，**P<0.01；與GS 組相比，##P<0.01.

組別KB LS GS劑量/（g·（kg·d）-1）/3.73 3.83 BUN/（mmol·L-1）5.76±0.94 16.90±1.00**##6.90±0.57 CR/（μmol·L-1）24.20±0.89 31.95±1.20**31.10±1.10**UA/（μmol·L-1）270.00±3.57 1 157.45±1.98**##398.00±5.95**

2.7 對腎臟組織形態的影響

顯微鏡下，KB 組組織結構未觀察到明顯異常，毛細血管未見充血和擴張，腎小球大小形狀也趨于正常；LS 組皮質部分存在大量炎性細胞浸潤并伴有水腫，部分細胞出現壞死現象，腎小球呈現明顯擴張狀態，甚至出現壞死溶解，髓質部分血管擴張充血嚴重；GS 組皮質部分觀察到少許炎細胞浸潤，腎小囊內伴有少量充血，髓質部分可見少量毛細血管擴張出血嚴重，見圖3.

圖3 大鼠腎臟HE 染色病理切片（×200）

2.8 對腎臟中TGF-β1的陽性表達的影響

TGF-β1的陽性表達呈現棕黃色顆粒，黃染程度越深，面積越大，表明陽性表達越高.在腎臟髓質部分和皮質部分，與KB 組相比，LS 組和GS 組的黃染程度和面積都明顯增大（P<0.01），而LS 組較GS 組黃染程度也明顯加深（P<0.01）.見圖4.

圖4 大鼠腎臟中TGF-β1 陽性表達（×200）

2.9 大鼠腎組織Nrf2 和HO-1 蛋白的表達

與KB 組 相 比，LS 組Nrf2 和HO-1 蛋 白 表達水平降低明顯（P<0.01），而GS 組降低不明顯，見圖5.

圖5 大鼠Nrf2 和HO-1 蛋白含量表達

3 討論

中藥雷公藤和及己都可用于治療炎癥，但均有一定的腎毒性，同時及己根的毒性較莖和葉小［8］.目前尚未有文獻報道及己根和雷公藤水提取物的腎毒性比較研究，因此，及己根和雷公藤的腎毒性大小有待深入研究，以觀察及己是否具有進一步的開發價值.

本研究中，大鼠的的體重變化情況和腎臟系數顯示，LS 組和GS 組大鼠體重增長和腎臟系數上升均較KB 組低，表明這兩組大鼠的腎臟組織皆出現了毒性損傷.而與GS 組相比，LS 組大鼠體重和腎臟系數的變化更為明顯.從大鼠腎臟組織HE 染色的病理切片也可以看出，LS 組和GS 組大鼠腎小管皮質部分已經出現了炎細胞，且LS 組的髓質部分擴張出血更為嚴重，以上結果表明，LS 組大鼠的腎組織受損較重.

作為評價腎功能的常規指標，血清CR 可以準確反應機體腎臟是否出現實質性受損，CR 值偏高，代表腎功能下降［9］.BUN 是衡量腎小球濾過功能的常規指標，當腎臟受損較嚴重或者受損時間較長時，BUN 數值異常升高［10］.UA 含量與腎功能密切相關，腎損傷時則會應激性升高［11］.當患者的腎功能出現異常時，CR、BUN 和UA 的數值會表現出不同程度的升高.本研究中，GS 組BUN 含量無顯著上升，而CR 和UA 含量都極顯著性升高，而LS組三個指標均極顯著性升高，表明LS 組引起了更為嚴重的腎毒性，該組大鼠腎損傷更加嚴重.

氧化應激損傷與腎組織損傷息息相關，當生物體內活性氧（ROS）成分過多，生物體內的氧化與抗氧化系統平衡就會被打破.大量的ROS 會產生具有毒性作用的活性氧分子如羥基自由基和亞硝酸陰離子等［12］.脂質氧化產物MDA 是衡量機體氧化脅迫程度的常用指標之一，過量的MDA 能導致膜脂過氧化，造成細胞膜損傷［13］.SOD 作為機體抗氧化酶，可有效清除O2-，避免細胞損傷，其含量高低可反映機體氧化應激的損傷強度［14］.本研究中LS 組T-SOD 含量的降低幅度和MDA 含量的升高幅度均較GS 組更大，表明LS 組大鼠氧化應激損傷更嚴重.

TGF-β1廣泛參與組織修復和炎癥等多種疾病過程，具有促纖維化作用，腎功能衰竭、腎炎和腎纖維化等疾病的發生均伴隨TGF-β1水平的升高［15］.TGF-β1還可以促進細胞凋亡和炎癥因子的產生，增加炎癥反應的發生風險.因此通過抑制TGF-β1的陽性表達可以減輕腎組織的損傷程度［16］.本研究中，LS 組和GS 組TGF-β1陽性表達均上升，LS 組上升最明顯，表明LS 組大鼠腎損傷較嚴重.

Nrf2/HO-1 通路可調節機體因內外環境變化引起的氧化應激反應.Nrf2 能夠抑制TGF-β1的表達、調節抗氧化酶的活性，還能激活下游HO-1 的表達.HO-1 存在于組織細胞中，可以清除機體內的氧自由基，防止機體出現氧化損傷［17］.但在毒性作用下，Nrf2 通路的激活受到抑制，導致HO-1 的表達也會相應減少，無法發揮保護效果［18］.本 研 究中，LS 組Nrf2 和HO-1 水平較GS 組下降更為明顯，表明LS 組的Nrf2/HO-1 通路被抑制的程度更大，所遭受的毒性損傷也更為嚴重.

本研究結果初步闡明了雷公藤水提物對大鼠所造成的腎組織損傷比及己根水提取物更為嚴重的事實，并證實了其腎損傷與Nrf2/HO-1 信號通路以及生物體內的氧化應激可能有關.但本研究并不能確定是否存在其他通路導致了大鼠的腎組織損傷，相關機制還需要進一步探索.

綜上所述，LS 組腎毒性大于GS 組，該機制可能為雷公藤水提取物通過誘導氧化應激損傷和抑制Nrf2/HO-1 信號通路導致更為嚴重的大鼠腎毒性.