腺苷三磷酸對人外周血單個核細胞hBD-2表達的影響及其分子機制探討

張夢潔

上海中醫藥大學附屬普陀醫院，上海200062

人β防御素2（hBD-2）是第一個被發現的具有 可誘導表達特性的防御素［1］，廣泛分布于皮膚、支氣管肺部、子宮等部位，尤其以支氣管肺部表達最多。其具有良好的殺菌能力和抗病毒、抗真菌、抗腫瘤等多種生物學活性，能趨化多數免疫細胞，在固有免疫和特異性免疫中均有重要功能，因此在肺部炎癥性疾病中發揮重要作用。在自然條件下，hBD-2表達水平極低或不表達；在受到外界因素刺激誘導后，則在各種組織黏膜細胞中表達并上調，發揮其抗微生物和調節免疫的功能［2］。腺苷三磷酸（ATP）是一種輔酶，通過多種蛋白功能為機體多種合成反應提供所需能量，增強機體組織及細胞的代謝活性，因而其對治療各種疾病均有較強的針對性。目前，ATP已被廣泛應用于細菌、病毒、球蟲等引起的呼吸、消化及生殖系統疾病的臨床輔助治療。實驗研究發現，ATP可以上調大鼠防御素2（mBD-2）的表達，但ATP是否可以上調hBD-2的表達水平目前鮮有文獻報告。2016年9月—2017年7月，我們應用ATP體外刺激人外周血單個核細胞（PBMCs），觀察其是否可誘導hBD-2表達，并探討其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑 PBMCs分離液（Ficoll）及ATP干粉均購自美國Sigma公司，胎牛血清購自美國BI公司，青霉素鏈霉素溶液（雙抗）、RPMI-1640培養液、HBSS和PBS緩沖液均購自美國HyClone公司，臺盼蘭購自美國Gibco公司，人白細胞介素1β（IL-1β）和hBD-2酶聯免疫吸附（ELISA）測定試劑盒均購自武漢Elabscience公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標本來源與收集 經醫院倫理委員會批準，收集健康志愿者20名，男10例、女10例，年齡（35.2±10.5）歲，漢族，均已簽署知情同意書。無菌抽取健康志愿者外周血9 mL于EDTA管抗凝，2 h內進行PBMCs的分離。

1.2.2 人PBMCs的分離 采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法。用無菌吸管各取3 mL血液于3只15 mL離心管中，并各加入3 mL等量HBSS液進行1∶1稀釋，輕輕上下吹打，充分混勻；用10 mL注射器吸取搖勻的Ficoll 3 mL于15 mL離心管內，避免管壁殘留分離液（Ficoll∶稀釋前全血∶HBSS=1∶1∶1）；將離心管傾斜45°，槍頭緊貼管壁將稀釋全血沿管壁緩慢加于Ficoll液面上，注意保持兩者界面分層清晰。在室溫（20℃）下，用水平離心機以離心半徑10 cm、400 g離心30 min。離心后管內分為三層，在第一、二層交界處有一狹窄帶，呈白色云霧狀，以單個核細胞為主。用移液槍去除最上層，小心吸出PBMC層（1～2 mL），移至另一15 mL離心管中。加入6～8倍體積PBS洗滌2次，室溫下以離心半徑10 cm、400 g離心5 min，留取沉淀。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液1 mL重懸細胞，并配成單個細胞懸液。將重懸了PBMCs的RPMI-1640培養液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，顯微鏡下觀察并計數。用移液器吸取10 μL細胞懸液到離心管中，再加入0.4%臺盼藍10 μL染液，于顯微鏡下計數PBMCs，活細胞百分比達95%以上，達到實驗要求。

1.2.3 PBMCs分組與ATP干預 在超凈臺內，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基調整細胞密度為1×106/mL；將細胞懸液接種于96孔培養板，每孔100 μL；將PBMCs分為六組，每組設3個復孔。空白組不處理，0、25、50、100、200 μmol/L ATP組分別加入 HBSS液和 25、50、100、200 μmol/L ATP 100 μL，于37℃、5%CO2及相對濕度為95%的培養箱中培養。分別于培養12、24 h后終止培養，將各組培養后的細胞懸液轉移至1.5 mL無菌離心管中，標記編號后以離心半徑10 cm、1 500 r/min低溫離心10 min，留取適量培養上清液置-80℃冰箱內保存。

1.2.4 PBMCs培養上清液hBD-2、IL-1β檢測 收集培養上清液，以離心半徑10 cm、3 000 r/min離心5 min，取上清液，采用雙抗體夾心ELISA法檢測hBD-2和IL-1β，具體步驟按試劑盒要求。即加50 μL待測樣品及系列濃度的標準溶液在細胞因子單抗包被的酶標板上，室溫孵育使細胞因子結合到酶標板上，再加入二抗孵育結合；最后加底物液顯色30 min，用酶標儀在450 nm波長處測OD值并計算hBD-2和IL-1β含量。

1.3 統計學方法 采用SPSS22.0統計軟件。所有計量數據以-x±s表示，多組間比較行單因素方差分析，組間兩兩比較行LSD-t檢驗，組內不同時間點的比較行重復測量方差分析，相關關系采用Person相關性分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組PBMCs培養上清液中hBD-2水平比較 見表1。

2.2 各組PBMCs培養上清液中IL-1β水平比較 見表2。

2.3 ATP作用后PBMCs培養上清液中hBD-2與IL-1β水平的關系 經ATP作用12、24 h時，PBMCs培養上清液中hBD-2與IL-1β水平均呈正相關（r分別為0.494、0.725，P均＜0.01）。

3 討論

hBD-2是防御素家族中非常重要的成員，主要表達于皮膚、支氣管等各種黏膜上皮細胞，外周血中的中性粒細胞和單核細胞在致炎因子刺激下也可以表達 hBD-2［3-4］。在高濃度時，hBD-2 對病原微生物具有直接殺傷作用；而低濃度時，hBD-2就只有趨化性，它可趨化募集樹突狀細胞、T淋巴細胞、白細胞、肥大細胞和巨噬細胞等，使這些細胞聚集在感染部位、誘導分化成熟、促進細胞因子產生；而這些細胞及細胞因子反過來又影響hBD-2的誘導表達，從而對機體的免疫狀態產生影響。hBD-2也可通過激活G蛋白偶聯受體和磷脂酶C途徑還能與肥大細胞表面兩種特異性受體結合，從而誘導肥大細胞聚集到炎癥部位并活化、脫顆粒、釋放組胺，參與速發型超敏反應［5］。研究顯示，hBD-2是Toll樣受體（TLR）的內源性配體，通過TLR2、TLR4、CC趨化因子受體6（CCR6）等受體介導，在IL-1相關蛋白激酶（IRAK）和腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）等信號轉導分子的協同作用下，觸發細胞內信號級聯反應，激活NF-κB，活化T淋巴細胞，觸發強有力的特異性免疫應答［6］。YANG等［7］發現，hBD通過CCR6途徑誘導的未成熟樹突狀細胞（iDC）的遷移，在hBD-2的刺激下通過CCR6促進iDC遷移，促進抗原提呈作用，激活T細胞，引發免疫應答。

表1 各組PBMCs培養上清液中hBD-2水平比較（）

表1 各組PBMCs培養上清液中hBD-2水平比較（）

注：與空白組比較，aP＜0.01；與0 μmol/L ATP組比較，bP＜0.01；與 25 μmol/L ATP組比較，cP＜0.01；與 50 μmol/L ATP組比較，dP＜0.01；與同組培養12 h比較，eP＜0.01。

images/BZ_15_234_402_1193_520.png99.57± 9.03 117.71± 8.07abe 133.79± 8.69abce 114.87±12.73abce 150.40±10.02abcde 99.82± 9.57 0 μmol/L ATP組25 μmol/L ATP組50 μmol/L ATP組100 μmol/L ATP組200 μmol/L ATP組空白組93.17± 5.67 106.62± 8.85ab 113.31± 7.98ab 120.97±10.30abc 128.39±10.48abcd 93.97± 7.92

表2 各組PBMCs培養上清液中IL-1β水平比較（）

表2 各組PBMCs培養上清液中IL-1β水平比較（）

注：與空白組比較，aP＜0.01；與0 μmol/L ATP組比較，bP＜0.01；與 25 μmol/L ATP組比較，cP＜0.01；與 50 μmol/L ATP組比較，dP＜0.01；與100 μmol/L ATP組比較，eP＜0.01；與同組培養12 h比較，fP＜0.01。

24 h 14.08±2.50 17.34±2.29abf 19.93±3.69abf 24.32±4.42abcdf 27.41±4.06abcdef 13.00±2.05組別0 μmol/L ATP組25 μmol/L ATP組50 μmol/L ATP組100 μmol/L ATP組200 μmol/L ATP組空白組IL-1β 12 h 10.92±2.43 12.61±4.60 14.30±4.08ab 17.35±2.76abc 18.83±3.38abcd 10.66±2.75

有研究發現，ATP還具有細胞間信息傳遞功能［8］，可提高細胞內鈣離子水平，促進鈣離子參與調節細胞的多種生物學功能。鈣非特異性調節劑ATP能通過與特殊受體（P2-嘌呤受體）結合，促進磷酸肌醇激酶的水解，從而引起鈣動員、胞內鈣升高，導致細胞的特殊反應；這些反應依據細胞類型不同而異，并且與細胞的功能有關［9］。hBD-2在自然條件下表達水平極低或不表達，當受到刺激誘導后則在各種組織黏膜細胞中表達并上調，發揮其抗微生物和調節免疫的功能［2］。hBD-2的可誘導表達特性，為利用某種人工方式調控其表達提供了理論依據。PBMCs為免疫活性細胞的集合體，包括T淋巴細胞、B淋巴細胞、NK細胞、單核細胞等免疫活性細胞，尤其T淋巴細胞，在機體免疫反應中扮演重要作用。hBD-2能趨化多數免疫細胞，因而在固有免疫和特異性免疫中均起著重要作用。

為探索人工促進hBD-2表達上調的方法，以進行體內研究且能應用于臨床，并進一步探討hBD-2與機體免疫狀態的關系。本研究先提取人PBMCs，用培養基調節至一定濃度后接種于培養板中，分別加入不同濃度的ATP液于培養箱中培養，分別于12、24 h收集細胞培養上清液，用ELISA法檢測其上清中的hBD-2及IL-1β。結果發現，與空白組和0 μmol/L ATP組比較，經不同濃度ATP組處理后，PBMCs細胞培養上清中hBD-2及IL-1β表達水平出現不同程度的上調，差異有統計學意義；且隨著ATP濃度適當的增加及作用時間的延長，細胞培養上清液中hBD-2及IL-1β的表達水平可進一步升高。本研究結果進一步證明了ATP可以誘導人體內hBD-2和IL-1β表達，并可通過人體免疫細胞發揮作用，在增強機體免疫方面起極為重要的作用。本研究結果提示，經ATP處理后，PBMCs培養上清液中hBD-2與IL-1β的表達水平呈正相關，這與SUN等［10］發現大鼠肺組織中mBD-2與IL-1β表達呈正相關這一觀點相符。目前的研究表明，hBD-2的誘導表達可能是通過多種信號途徑實現的，核轉錄因子κB（NF-κB）信號通路被外來刺激信號激活可能是hBD-2基因激活的機制之一，hBD-2的表達是通過激活NF-κB、在IL-1β及TNF-α參與下實現的［11］。也有研究表明，ATP是促進巨噬細胞中IL-1β成熟與分泌的重要內源性刺激物［12-13］。結合本研究可以推測，ATP作用于PBMCs后使細胞內鈣離子濃度增高，導致NF-κB信號通路激活，從而誘導細胞因子如IL-1β和hBD-2表達，使細胞內IL-1β和hBD-2的分泌增加；而hBD-2反過來趨化免疫細胞，促進產生細胞因子如IL-1β，這些細胞因子反過來又影響hBD-2的誘導表達，兩者相互影響；但ATP也有可能通過直接刺激PBMCs分泌IL-1β，進而介導hBD-2的表達上調。當然，激活hBD-2基因表達還存在其他機制，如IL-6、JAK/STAT途徑等。有研究認為，其他部位的上皮細胞誘導hBD-2表達的信號轉導機制與氣道上皮細胞可能不同［14-15］。例如 KRISANAPRAKORNKIT 等［16］發現，通過絲裂原素活化蛋白激酶通路可以實現齒齦上皮細胞hBD-2的表達，而不是NF-κB激活通路。MOON等［17］用前炎癥細胞因子IL-1α刺激中耳上皮細胞表達hBD-2，發現這是通過Raf-MEK1/2-ERK依賴性信號通路發生的；但MCDERMOTT等［18］在角膜上皮細胞用IL-1β刺激hBD-2的表達時，發現此過程既有NF-κB信號通路，也有絲裂原蛋白激酶信號通路。由此可見，各種刺激因素對hBD-2的誘導表達可能是通過多種信號途徑實現的。ATP刺激PBMCs誘導hBD-2表達的具體機制和途徑，尚需進一步研究。ATP作為臨床常用藥物，每日使用劑量可達100～200 mg。本研究提示，25 μmol/L ATP即可誘導hBD-2表達上調，這與臨床上ATP使用劑量相比是極其微量的，這為肺部感染患者臨床上使用小劑量ATP來誘導機體hBD-2的表達并輔助抗感染提供了依據。