大鼠心肌延遲缺血再灌注損傷模型的建立及其心功能和心肌細胞凋亡情況觀察

唐詠文，崔同濤，劉勇，王敏，郭濤，劉津，譚寧

1廣東省人民醫院（廣東省醫學科學院），廣州510080；2廣州醫科大學附屬第一醫院

急性心肌梗死（AMI）不僅導致心肌損傷，還可誘發慢性心力衰竭。心臟對缺血缺氧敏感，再灌注后出現心肌損傷加重，甚至誘發心功能惡化［1］，即缺血再灌注損傷（IRI）。細胞發生IRI時心肌細胞凋亡增加，從而導致心功能降低［2］。當延遲再灌注或再灌注后出現慢血流、持續泵衰竭或休克時，特別是再灌注后心肌酶學持續升高時，如何有效降低再灌注損傷是治療的關鍵。研究顯示，AMI后24～48 h接受延遲經皮冠狀動脈介入再灌注治療的院內病死率和重度左心室功能不全發生率較常規藥物組降低［3］。因此，認識延遲再灌時心肌損傷機制可為探索更優的治療方案提供基礎支持，而建立相應的動物模型是研究的前提。為了更加接近臨床早期IRI過程，2016年1月—2018年6月我們在動物模型上實現較長缺血后的有效再灌注，并觀察心肌細胞凋亡及心功能的變化加以驗證。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級雄性SD大鼠105只，8～10周齡，體質量200～270 g，購自廣東中醫藥大學實驗動物中心。實驗在屏障系統中完成，飼養環境溫度23～29℃，相對濕度40%～50%。實驗已通過廣東省人民醫院動物實驗倫理［倫理號：GDREC2014016H（R1）］，操作遵守國家衛生研究院實驗動物福利實驗指南。

1.1.2 主要試劑與儀器 三苯基四唑氯化物（TTC，上海Invitrogen），依文思藍（Evens Blue，美國Sigma），TUNEL試劑盒（瑞士Roche），Bax抗體、Bcl-2抗體、激活態Caspase-3（Cleaved Caspase-3）抗體（美國CST），GAPDA抗體（美國Protein Tech.）。小動物呼吸機R407（深圳瑞沃德），動物心電圖機（成都泰盟BL-420F生物機能實驗系統），倒置顯微鏡（德國萊卡），M型動物心臟超聲儀（日本Visual Sonics Vevo 2100）。

1.2 大鼠心肌缺血模型的制備 大鼠禁食過夜，10%水合氯醛腹腔注射麻醉。18 G留置針行經口腔氣管插管，外套管連接呼吸機（正壓通氣，潮氣量2.5～3.0 mL/100 g，頻率70～80次/分），四肢連接心電圖機導聯。大鼠仰臥固定，開胸暴露心臟及左前降支（LAD）。以6-0縫線在直視下于肺動脈圓錐根部進針，左心耳下2.0～3.0 mm處出針過線，針寬2.0～3.0 mm，針深0.5～1.0 mm。輕提縫線見前壁心肌顏色變淡，為結扎有效。在結扎處心臟表面放置5.0 mm的橡皮筋，在其上打結。以前壁心肌呈蒼白色、心電圖Ⅱ導聯ST段弓背抬高大于0.1 mV為缺血成功。

1.3 大鼠心肌延遲再灌注時間的篩選 選取心肌缺血模型大鼠42只，分別于缺血1 h（n=6）、4 h（n=10）、6 h（n=10）、12 h（n=10）、24 h（n=6）后重新開胸并打開線結，使心肌再灌注15～20 s，以前壁心肌顏色恢復、5 min內ST段回落超過50%判斷為再灌注成功。

1.4 動物分組與處理 取大鼠63只，分為假手術組17只、及時再灌組23只、延遲再灌組23只。及時再灌組和延遲再灌組按照1.2方法制備心肌缺血模型，假手術組僅穿線不結扎。及時再灌組于缺血1 h、延遲再灌組于缺血4 h后，拆開縫線，打開線結，再灌注15～20 s。按1.3方法判斷為再灌注成功后，逐層縫合胸腔。

1.5 大鼠心肌缺血面積測算 采用TTC/Evens Blue雙染色法。及時再灌組、延遲再灌組各取6只大鼠，再灌注24 h后于升主動脈根部注射10%伊文思藍1.5～2.0 mL?？焖偾谐呐K，以預冷的PBS沖洗，在30 mmol/L KCl溶液中停跳后，-20℃冷凍15 min。自結扎水平將心臟橫切成1 mm厚切片，加入1%TTC溶液，37℃溫育10～15 min。缺血區包括紅染的危險區及白色的壞死區，藍染的正常區。相機（Canon EOS 800D，600 dpi）拍照并采用Image J軟件分析危險區面積（AAR）、梗死區面積（IA）、左心室總面積（LV），分別以（IA+AAR）/LV表示缺血區、IA/AAR表示壞死區、AAR/LV表示危險區大小。

1.6 大鼠缺血危險區心肌細胞凋亡情況觀察 采用改進TUNEL法［4］。三組各取3只大鼠，再灌注24 h后處死。取結扎點下2 mm處心肌橫斷面，石蠟包埋，切100 μm厚切片。加入40 g/L多聚甲醛固定，2 mg/mL蛋白酶K溶液通透樣本；加入450 μL熒光素片段末端標記反應混合物以及50 μL TdT酶行標記反應，封片并激發，在綠色熒光濾片下觀察標記的紅色熒光凋亡細胞。先在低倍鏡下選擇缺血危險區，然后在高倍鏡下選擇3個視野進行熒光拍照，采用Image J軟件計算細胞凋亡率［5］。

1.7 大鼠缺血危險區心肌組織中凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3檢測 三組各取6只大鼠，再灌注24 h后處死。取缺血危險區心肌組織1 mg剪碎，加入蛋白裂解酶裂解，離心取上清，BCA法測定總蛋白濃度。煮沸變性后，SDS-PAGE電泳；采用10%分離膠，PVDF膜轉膜，5%脫脂奶粉封閉。加入一抗（稀釋濃度：GAPDH為1∶5 000，Bax、Bcl-2均為1∶500，Cleaved Caspase-3為1∶1 000），孵育過夜。加入二抗（稀釋濃度1∶5 000）孵育，洗膜后ECL化學發光法自動曝光并保存。用Image J軟件計算蛋白灰度值，以目標蛋白與內參GAPDH的比值計算蛋白的相對表達量。

1.8 大鼠左心室形態及功能檢查 三組各取8只大鼠，再灌注72 h后行M型心臟超聲檢查。在左心室長軸切面測量左心室收縮末直徑（LVDs）、左心室舒張末直徑（LVDd）、左心室短軸縮短率（FS），在四腔心切面計算左心室收縮末容積（LVDsV）、左心室舒張末容積（LVDdV）；Simpson′s法計算左心室射血分數（LVEF）、每搏射血量（SS）和心輸出量（CO）。

1.9 統計學方法 采用SPSS18.0統計軟件。計量資料以表示，兩組間比較行獨立樣本t檢驗；多組間比較行單因素方差分析，組間兩兩比較行LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠心肌延遲再灌注時間的篩選結果 缺血12 h及24 h后再灌注，心肌顏色固定無恢復、心電圖示心肌梗死Q波形成，提示無法成功再灌注；缺血6 h后再灌注，僅2只大鼠成功再灌注；缺血4 h后再灌注，LAD可自行開通，心肌顏色恢復，心電圖ST段回落；缺血1 h后再灌注，心肌顏色恢復，ST段回落并伴有心率恢復或室性早搏等心律失常表現。故將缺血1 h后再灌注作為及時再灌注時間，缺血4 h后再灌注作為延遲再灌注時間。

2.2 及時再灌組與延遲再灌組大鼠心肌缺血情況比較 見表1。

表1 及時再灌組與延遲再灌組大鼠心肌缺血情況比較（）

表1 及時再灌組與延遲再灌組大鼠心肌缺血情況比較（）

注：與及時再灌組比較，*P＜0.05。

images/BZ_24_1284_1519_2243_1578.png延遲再灌組及時再灌組0.29±0.05 0.35±0.14 6 6 0.58±0.26*0.35±0.11 0.54±0.03*0.42±0.12

2.3 三組大鼠缺血危險區心肌細胞凋亡率比較假手術組、及時再灌組、延遲再灌組心肌細胞凋亡率分別為2.1%±0.3%、6.4%±1.2%、10.7%±1.7%，及時再灌組、延遲再灌組心肌細胞凋亡率高于假手術組，延遲再灌組高于及時再灌組（P均＜0.01）。

2.4 三組大鼠缺血危險區心肌組織Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3蛋白表達比較 見表2。

表2 三組大鼠缺血危險區心肌組織Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3蛋白表達比較（-x± s）

2.5 三組大鼠左心室形態及功能比較 見表3。

表3 三組大鼠左心室形態及功能指標比較（）

表3 三組大鼠左心室形態及功能指標比較（）

注：與假手術組比較，*P＜0.01；與及時再灌組比較，#P＜0.01。

組別延遲再灌組及時再灌組假手術組CO（mL/min）29.20± 2.91*30.87± 7.35*59.54±19.94 n 8 8 8 LVDs（mm）5.05±0.86*4.41±0.65 4.02±0.78 LVDd（mm）6.31±0.57 5.81±0.61*6.71±1.10 LVDsV（μL）125.37±45.04*#90.60±31.32 74.38±26.40 LVDdV（μL）203.61±40.87 169.77±37.41*239.74±81.47 FS（%）20.36±7.27*24.35±5.83*40.39±6.22 LVEF（%）40.17±12.23*#47.27± 9.36*69.36± 7.32 SS（μL）78.24± 9.76*79.16±19.98*165.37±58.91

3 討論

良好的動物模型是開展基礎研究的前提和關鍵，本實驗選取具有基因背景清楚、冠狀動脈側支少、心肌壞死出現早及重復率高等優勢的SD大鼠作為心肌IRI建模動物。我們發現，心肌持續缺血4 h后自行開通率較高、重復性好，可以從組織細胞分子及心臟形態功能等層面較好地模擬心肌延遲IRI。實驗采用呼吸機輔助通氣下原位心臟血管結扎致心肌缺血，既避免因心臟擠壓至胸腔外影響心臟泵功能及心電，又避免因多次牽拉導致造模失敗。在模型制作過程中，結扎過程是關鍵。采用較粗的6-0無創縫線［6］作為結扎線可以減少心肌損傷；依據可視血管走行及相對解剖結構判斷進出針位置，進針的深度及寬度盡量保持一致，盡量一次成功以保證實驗的可重復性。結扎松緊度也影響實驗的效果，過緊易導致血管斷裂、心肌損傷，過松易造成不完全缺血。所以，我們選擇有一定柔軟度的橡皮筋作為壓迫LAD 的介質，避免用縫線［7］或聚乙烯管［8］等硬壓迫物對血管造成損傷的可能，且容易取出。這樣不僅可以通過壓痕及心肌顏色變化控制張力，還可以有效避免縫線對LAD血管的直接切割損傷，對有效再灌注起積極作用。

在延遲缺血時間的摸索中，我們曾嘗試術前腹腔注射肝素50 IU/100 g抗凝以延長缺血時間；結果發現，術野滲血明顯可影響觀察心肌顏色變化，大鼠胸腔內積血或氣管內出血明顯可導致大鼠窒息死亡。與心肌酶譜、心臟超聲、心肌磁共振相比，TTC/Evens Blue雙染色具有經濟、重復性強、對比性好的優勢，是評估再灌注損傷應用最多的檢測方法。本研究發現，TTC/Evens Blue雙染色可較好標示缺血梗死區、危險區及正常區，延遲再灌組壞死區、缺血區均較及時再灌組增大，且兩組均有明顯的危險區。這提示兩組具備典型的IRI組織學表現，而延遲再灌組可更好地模擬臨床心肌延遲IRI。

細胞凋亡是細胞一種可調控的死亡過程，調控或干預凋亡過程是一種有效挽救心肌的方法［9］。對于處于非致死性刺激（如缺血邊緣區）的心肌細胞，凋亡是一種主要的病理改變過程［10］。心肌細胞凋亡率越高則梗死后心力衰竭的概率越大，且缺血再灌注時較單純缺血發生的細胞凋亡比例更高［11-12］。在心肌IRI中細胞凋亡起著舉足輕重的作用，抑制細胞凋亡是降低IRI的治療策略。線粒體參與調控細胞凋亡［13-14］，而內源性線粒體途徑在心肌IRI細胞凋亡中起主要的調控作用［15］。Caspase-3作為核心執行蛋白參與線粒體途徑介導的凋亡過程，而Cleaved Caspase-3可反映其活性高低。凋亡執行蛋白中，Bax有明確的促凋亡作用，而Bcl-2有明確的抑制凋亡作用［16］，兩者比值可有效反映細胞凋亡的程度。本研究結果顯示，及時再灌組、延遲再灌組缺血危險區心肌細胞凋亡率高于假手術組，延遲再灌組高于及時再灌組；及時再灌組和延遲再灌組Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達均高于假手術組，及時再灌注組Cleaved Caspase-3蛋白表達高于延遲再灌組，三組Bcl-2蛋白表達差異無統計學意義。這提示兩組具備典型的IRI細胞分子學表現，而延遲再灌組可更好地模擬臨床心肌延遲IRI。

心肌IRI發生后，心肌組織缺血壞死和心肌細胞凋亡最終導致心臟形態與功能的改變。本研究采用結扎心臟LAD造模，對左心室形態和功能的影響最明顯。再灌注72 h，采用動物超聲儀檢查左心室形態及功能指標；結果顯示，與假手術組比較，延遲再灌組和及時再灌組FS、SS、LVEF、CO均下降，且延遲再灌組LVDsV、LVEF均低于及時再灌組。這進一步提示延遲再灌組心肌形態及收縮功能受損更明顯，可更好地模擬臨床心肌延遲IRI。

綜上所述，SD大鼠心肌缺血4 h后再灌注自行開通率較高、重復性好，并可引起凋亡蛋白表達異常，從而導致明顯的心肌細胞凋亡及左心室收縮功能下降，表明該模型可以從組織細胞分子及心臟形態功能等層面較好地模擬臨床心肌延遲IRI。