補陽還五湯抑制大鼠肺纖維化及對肺組織TGF-β/Smads信號通路的影響

李曉明，李作鹽，石坷，林大永

遼寧省健康產業集團鐵煤總醫院，遼寧鐵嶺112700

肺纖維化（PF）是一種慢性肺部疾病，表現為成纖維細胞過度積累，細胞外膠原異常沉積，肺泡結構破壞，導致肺的順應性降低，最終發生肺功能障礙［1-2］。PF既可由病毒感染、放療暴露、化療藥物損傷或霧化環境毒素損害等引發，也可由類風濕關節炎或系統性硬化等結締組織病或免疫系統疾病并發。在肺纖維化形成過程中，有多種信號通路的參與，其中轉化生長因子β（TGF-β）/Smads信號轉導通路的活化具有關鍵性作用。PF患者預后極差，確診后生存期僅為2.5～3.5年［3］。雖然近年來在PF的藥物治療上取得了一定的進展，如nintedanib和pirfenidone等生物制劑能夠延緩PF進展［4-5］，但不良反應較為突出，限制了其臨床應用。PF在中醫學上屬于肺痿、肺痹范疇，與肺氣虛弱、氣血瘀滯有關，多采取益氣活血方劑進行治療。補陽還五湯是中醫名方，具有補氣、活血、通絡的功效，可治療半身不遂之中風，臨床發現其對PF亦具有較好效果。2020年4月—5月，我們觀察了補陽還五湯對大鼠PF的抑制作用，并通過TGF-β/Smads通路活性變化進一步探討其治療的機制，為該方的開發應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要藥品、試劑及儀器 補陽還五湯煎劑（生黃芪120 g、當歸尾 3 g、赤芍 5 g、地龍 3 g、川芎 3 g、紅花3 g、桃仁3 g，水煎后去渣，濃縮至含生藥1 g/mL），博萊霉素（天津太和制藥有限公司）；RNA抽提試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）試劑盒、互補脫氧核糖核酸（cDNA）第一鏈合成試劑盒（南京建成生物工程研究所），TGF-β、p-Smad3一抗（武漢博士德公司），RIPA蛋白裂解液及白蛋白（BSA）定量試劑盒（浙江碧云天生物試劑公司），Pro-Flex型PCR儀（賽默飛世爾公司），EUROBlotMaster自動免疫印跡分析儀（德國歐蒙公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物飼養與分組 雄性SD大鼠，5～6周齡，體質量110～130 g，清潔級，購于中國上海SLAC實驗動物中心；于室溫、50%～70%濕度環境中飼養，定量喂食，自由飲水；所有操作符合《實驗動物管理條例》《關于善待實驗動物的指導性意見》，盡量減少動物痛苦；將大鼠飼養1周適應環境，取36只采用隨機數字表法分為對照組、模型組及干預組，每組12只，分籠飼養。

1.2.2 動物造模與藥物干預 模型組及干預組用博來霉素誘導PF模型，對照組不造模。三組采用2%戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射麻醉后，將大鼠固定于動物解剖臺；消毒，頸部正中切開，顯露氣管；模型組及干預組向氣管內注入5 mg/L博來霉素溶液0.3 mL，對照組注入等體積生理鹽水；注入后翻轉動物，使藥物在肺部均勻分布。將大鼠分籠飼養，自由飲水，定量喂食；大鼠出現活動力下降，撓鼻、咳嗽等呼吸道癥狀表示造模成功。造模1周后干預組每日以補陽還五湯煎劑4 g/kg灌胃，2次/天；模型組和對照組每日以等體積生理鹽水灌胃，使用方法同干預組。各組均連續給藥1周。

1.2.3 肺組織標本采集 大鼠造模1周后，斷頭法處死。消毒開胸，解剖分離肺組織；取左肺放入DEPC水中處理后以甲醛固定，脫水后常規石蠟包埋；取右肺上中葉保存于冷凍管中，迅速置于液氮中備用。

1.2.4 肺組織病理學觀察及肺泡炎癥、PF程度評價 肺組織病理切片行HE染色和Masson染色，光鏡下觀察病理組織學變化并攝片，參照Szapiel方法評價大鼠肺泡炎癥反應程度及PF程度。肺泡炎癥程度評分：0分為肺泡腔內無炎癥滲出，肺組織結構正常；1分為肺泡腔內可見單核細胞滲出，局部可見肺泡間隔增寬，肺間質病變面積＜20%，肺泡結構基本正常；2分為肺泡內可見較多炎癥細胞，肺間質病變面積20%～50%；3分為肺泡腔內大量炎癥細胞或實變，肺間質病變面積＞50%。PF程度評分：0分為無PF；1分為輕度，PF病變面積＜20%；2分為中度，PF病變面積20%～50%；3分為重度，PF病變面積＞50%。

1.2.5 肺組織TGF-β、Smad3 mRNA檢測 采用RT-PCR法。肺組織標本解融，剪碎后研磨，制備勻漿；TRIzol法提取總RNA，使用第一鏈cDNA合成試劑盒轉錄合成cDNA。分別在280、260 nm波長下，采用分光光度計法計算RNA原液濃度和OD260/OD280。根據RNA原液濃度以及試劑盒說明調整RNA濃度，使RNA稀釋液濃度為500 ng/μL。按試劑盒要求配制反應體系，反應條件為37℃15 min、85℃5 s，4℃保存。合成的cDNA于-20℃保存。引物序列：TGF-β上游引物 5′-GTTCCTGCCATTCTGGTGCA-3′、下游引物 5′-TGCGTGTCAGGGGTTGGTTAC-3′，Smad3 上 游 引 物 5′-CTACCGACTGCGAGGCATAA-3'、下游引物5'-CGAGCCGATACATCGATCCT-3'，內參GAPDH上游引物5'-CAGATGCTCGCAAGGTAGGA-3′、下游引物5′-ACAGAAGTAGTACGCAGACTG-3′。反應條件：50 ℃ 2 min，95℃ 2 min預變性；95℃ 15 s變性，60℃ 1 min退火，共40個循環；95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s、60℃15 s延伸。使用ABI Prism 7500序列檢測系統進行三次反應，通過2－ΔΔCt分析TGF-β、Smad3 mRNA相對表達量。

1.2.6 肺組織TGF-β、p-Smad3蛋白檢測 采用免疫印跡法。將深低溫保存的肺組織于液氮中充分研磨，用RIPA溶解緩沖液在冰上提取肺組織蛋白；以離心半徑15 cm、12 000 r/min離心5 min，吸取上清液；加入苯基甲基磺酰氟蛋白酶抑制劑，采用Bradford法測定樣品蛋白濃度。在12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離出每個樣品中等量的蛋白（50 mg），轉移到直徑0.22 μm的硝化纖維素濾膜上；滴加TGF-β（1∶1 000）、p-Smad（1∶1 000）和 β-actin（1∶3 000）一抗，4℃下搖床溫育過夜；滴加山羊抗兔IgG二抗，室溫下孵育1 h，沖洗后加入ECL發光液。采用美國Pierce、Rockford等超級信號Western Pico化學發光基板，用Quantity One軟件對信號進行可視化處理，以目的蛋白與內參光密度比值表示其相對表達量。

1.3 統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較行單因素方差分析，組間兩兩比較行LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肺組織病理變化 HE染色顯示，對照組肺組織結構正常，無間隔水腫、肺泡可見少許炎癥細胞浸潤和膠原纖維沉積；模型組肺組織炎癥反應明顯，肺泡內可見大量炎癥細胞滲出，成纖維細胞增生，形成大面積纖維化病灶；干預組肺組織炎癥反應較為明顯，肺泡內可見炎癥細胞滲出，肺組織可見成纖維細胞增生，部分區域可見纖維化病灶。

2.2 各組大鼠肺泡炎癥及PF程度比較 大鼠肺泡炎癥評分及PF評分模型組高于對照組，而干預組低于模型組（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠肺泡炎癥評分、PF評分比較（分，）

表1 各組大鼠肺泡炎癥評分、PF評分比較（分，）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

images/BZ_42_234_2378_1193_2437.png干預組模型組對照組12 12 12 FP 1.38±0.56*#2.43±0.29*0.14±0.41 18.533 0.003 1.26±0.61*#2.32±0.21*0.26±0.02 26.112 0.002

2.3 各組大鼠肺組織TGF-β、Smad3 mRNA表達比較 大鼠肺組織TGF-β、Smad3 mRNA表達水平模型組高于對照組，而干預組低于模型組（P均＜0.05）。見表2。

2.4 各組大鼠肺組織TGF-β、p-Smad3蛋白表達比較 肺組織TGF-β、p-Smad3蛋白表達水平模型組高于對照組，而干預組低于模型組（P均＜0.05）。見表3。

表2 各組大鼠肺組織TGF-β、Smad3 mRNA表達比較（）

表2 各組大鼠肺組織TGF-β、Smad3 mRNA表達比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

images/BZ_42_1284_403_2243_462.png干預組模型組對照組12 12 12 FP 0.83±1.05#0.94±0.12*0.73±0.61 19.362 0.003 0.37±0.15#0.42±0.12*0.34±0.15 22.123 0.001

表3 各組大鼠肺組織TGF-β、p-Smad3蛋白表達比較（）

表3 各組大鼠肺組織TGF-β、p-Smad3蛋白表達比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

images/BZ_42_1284_904_2243_963.png干預組模型組對照組12 12 12 FP 0.34±0.09#0.79±0.01*0.28±0.01 25.118 0.002 0.44±0.09#0.78±0.01*0.39±0.03 25.693 0.003

3 討論

PF是由各種原因所致肺組織細胞外基質聚集、炎性損傷及間質纖維細胞增殖，最終引起PF；肺組織的順應性下降，同時伴有肺泡結構的損傷，肺的通氣及換氣功能障礙，最終導致呼吸功能下降或衰竭。PF的發病機制復雜，炎性損傷、免疫反應及遺傳學因素等均參與PF的過程。雖然，近年來PF的臨床治療取得了一定進展，但臨床療效仍不理想，大部分患者最終會進展為呼吸功能衰竭，預后極差。PF發生的中心環節是肺實質纖維組織過度增生，與細胞增殖有關的細胞因子、信號通路和PF的發生密切相關，如在PF過程中TGF-β/Smad3信號通路的激活。TGF-β通過激活其受體觸發細胞反應，從而觸發Smads磷酸化［7］；磷酸化后Smad2、Smad3與Smad4形成異構體復合物，復合體轉位到細胞核并打開基因轉錄，因此抑制Smads能夠降低TGF-β信號通路的活性。Smad3特異性抑制劑SIS3可抑制Smad3的磷酸化，可以抑制TGF-β處理的人真皮成纖維細胞的肌成纖維細胞分化和膠原生成，可通過抑制TGF-β/Smad3信號通路來改善纖維化、凋亡和炎癥反應［8］；此外，SIS3能夠通過抑制上皮—間充質轉化（EMT）和纖維化延緩1型糖尿病小鼠模型糖尿病腎病的早期發展［9］。這些研究表明，抑制 TGF-β/Smad3信號通路功能及活性可能在纖維化相關疾病的治療中具有重要作用［10-11］。

中醫學對PF的治療由來已久，多從肺痿、肺痹施治。中醫學認為，肺臟虛損，津氣耗傷，血脈瘀阻，以致肺葉枯萎。肺痿屬內傷虛證，病情較重且遷延難愈，因此中醫多采用補氣活血功效的方劑進行治療。補陽還五湯出自清代王清任《醫林改錯》，具有益氣、活血、通絡的作用，在氣虛血瘀所致胸痛、痹癥等治療中具有極其重要的臨床價值。現代醫學研究顯示，補陽還五湯方劑具有抗炎、抗氧化、抑制細胞凋亡等作用。本研究發現，在博來霉素誘導的PF大鼠模型肺組織發生明顯的肺泡炎癥及纖維化等改變，但在采用補陽還五湯干預的干預組大鼠肺泡炎癥及PF評分均明顯低于模型組，說明補陽還五湯能減輕博來霉素誘導的大鼠PF模型的肺部炎癥損害和纖維組織增生；進一步研究發現，模型組大鼠肺組織TGF-β、Smad3 mRNA及蛋白表達上調，而干預組TGF-β、Smad3 mRNA及蛋白上調水平低于模型組。這說明TGF-β/Smad3信號通路激活參與PF的過程，而補陽還五湯能夠抑制TGF-β/Smad3信號通路中Smad3的磷酸化過程，進而降低TGF-β/Smad3信號通路活性，發揮抑制肺部炎癥反應及PF的作用。既往研究表明表明，TGF-β/Smads信號通路在PF的發病機制中起重要作用，養陰益氣合劑對TGF-β/Smads信號通路具有調節作用，提示具有補益作用的中藥對PF具有治療作用［13］。在纖維細胞活化及增殖過程中，TGF-β信號通路激活是導致組織或臟器纖維化的原因之一；其能通過上調氧化因子、金屬彈性蛋白酶以及抑制細胞凋亡等途徑加速纖維細胞的沉積［14-17］，對其誘導纖維化過程的細胞因子或轉導信號活性進行干預是防治PF的有效途徑［18］。補陽還五湯含有黃芪、當歸、赤芍、地龍、川芎等有效成分。既往研究顯示［19-20］，黃芪中的多糖組分能夠通過調節TGF-β1/Smads信號通路對百草枯誘導的大鼠PF發揮拮抗作用；同時，也能通過抑制mTOR及其下游p-S6的表達，影響α平滑肌肌動蛋白生成，干預博來霉素誘導的大鼠PF發生。當歸中多糖、當歸醇等組分能通過抑制TGF-β、血管內皮生長因子表達，延緩博來霉素誘導的PF大鼠模型肺部病變的進展。以上研究提示，補陽還五湯中的藥物組分對PF的調節可能通過多途徑發揮作用。

綜上所述，補陽還五湯能夠減輕PF大鼠肺組織炎癥及纖維化程度，可能與其抑制肺組織TGF-β/Smad3信號通路中TGF-β蛋白表達同時降低Smad3磷酸化水平有關，這為臨床應用補陽還五湯治療PF提供了一定的理論支持。