白靈芝提取物對大鼠肝星狀細胞增殖、活化及Wnt/β-catenin信號通路的影響

肖毅力，張寶月，張亞紅，宋正己

1昆明理工大學醫學院，昆明650500；2云南省第一人民醫院

肝纖維化是所有慢性肝病發展為肝硬化必經的病理過程，是各種慢性肝病損傷修復過程的共同結果，并與肝癌的發生有關。肝纖維化發生的關鍵因素是肝星狀細胞（HSC）的增殖和活化［1］，活化的HSC是肝組織中細胞外基質（ECM）的主要來源［2］，對HSC增殖與活化的抑制一直是抗肝纖維化研究的核心。在慢性肝損傷時，HSC激活表型轉化為表達α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）［3］。HSC的活化由許多炎癥細胞因子和生長因子介導，包括結締組織生長因子和轉化生長因子β1（TGF-β1）。TGF-β1是從HSC產生ECM的主要刺激物，且在纖維發生過程中表達增加［4-5］。此外，研究表明，持續的 Wnt/βcatenin通路激活與肺臟、肝臟、腎臟及皮膚纖維化等的發病機制有關［6］。Frizzled-4是Wnt/β-catenin信號通路的關鍵受體蛋白，Frizzled-4的表達量直接影響細胞內β-catenin水平，β-catenin的核內累積是Wnt信號通路活化的重要標志［7］。靈芝是中國傳統藥物，具有抗腫瘤、抗氧化、保肝等作用；白靈芝屬于靈芝的一種，為中國西南地區特有品種。2017年6月—2019年2月，我們觀察了白靈芝提取物（GLE）對大鼠HSC增殖、活化的影響，并探討其是否與Wnt/β-catenin信號通路有關，以期為防治肝纖維化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料 GLE由云南農業科學院昆蟲生物醫藥研發重點實驗室提供，于-20℃冰箱保存；大鼠HSC-T6購自中國科學院昆明動物所細胞庫。青霉素—鏈霉素雙抗（BI公司），CCK8（碧云天），特級胎牛血清（美國GIBCO），DMEM高糖培養基（BI公司）；一抗GAPDH、Frizzled-4、β-catenin抗體（英國Abcam），二抗兔抗兔（CELL SIGNALING），SDSPAGE凝膠試劑盒（碧云天），BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天），Chemidoc XRS成像系統（BIORAD），Trans-blot電泳槽組件（BIO-RAD）；SYBR熒光染料試劑盒（TAKALA公司），總RNA提取試劑盒（天根），Master Mix（TAKALA）實時熒光定量PCR儀（Aglient），超微核酸定量檢測儀（BIO-TEK）。

1.2 HSC-T6細胞培養 將復蘇后的HSC-T6接種于含10%胎牛血清DMEM高糖培養基中，在37℃、5%CO2培養箱中培養并傳代備用。在生物安全柜中用胰酶消化HSC-T6，用培養基配成5×105/mL的細胞懸液；將HSC懸液接種于96孔板，每孔加入細胞懸液100 μL；輕搖培養板以保證鋪板均勻，將鋪好的96孔板于恒溫培養箱中培養過夜。

1.3 GLE溶液制備 臨用前夜將GLE轉入4℃冰箱緩慢解凍，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基稀釋5倍；以0.22 μm微孔濾器過濾后，繼續用上述培養基分別稀釋10、25、50、100、200倍備用。

1.4 HSC-T6細胞增殖情況觀察及GLE作用時間、濃度篩選 在顯微鏡下觀察細胞貼壁后，吸出孔板中的培養基；GLE組將稀釋好的GLE加入96孔板中，每孔100 μL，每個濃度均設置6個復孔；對照組加100 μL含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基。左右輕微搖晃后，將96孔板放入恒溫培養箱中培養。分別于培養24、48、72 h，每孔加入CCK8溶液10 μL，在37℃恒溫箱孵育2～4 h。采用酶標儀在450 nm波長處測定各孔OD值，各復孔OD值取平均數，以此表示細胞增殖情況；OD值越小，則抑制作用越強；選擇與對照組有統計學差異的干預時間，作為后續研究的作用時間。根據藥物各濃度組的細胞增殖抑制率計算GLE干預的半數抑制濃度（IC50），選擇小于該濃度的GLE進行后續實驗干預。增殖抑制率=（對照孔OD值-實驗孔OD值）/對照孔OD值×100%。

1.5 HSC-T6細胞活化情況觀察 將對數生長期的HSC接種于6孔板，于培養箱中培養24 h后棄去上清液；干預組加入1.4篩選濃度的GLE 1.5 mL于6孔板中，對照組加入等體積的完全培養基，繼續培養48 h。加入裂解液RZ，用移液器不斷吸取裂解液并吹打孔板中的細胞，使細胞被充分、均勻裂解。根據總RNA提取試劑盒說明提取RNA備用，按照逆轉錄試劑盒配制20 μL的逆轉錄反應體系得到cDNA，參考試劑盒說明書將cDNA進行實時熒光定量PCR。以GAPDH為內參，按照2－ΔΔCt計算目的基因的相對表達量。引物序列：α-SMA上游為5′-TGGTATTGTGCTGGACTCTG-3′，下游為5′-CCATCAGGCAGTTCGTAG-3′；TGF-β1上游為5′-CCCGCATCCCAGGACCTCTCT-3′，下游為5′-CGGGGGACTGGCGAGCCTTAG-3′；內參 GAPDH上游為 5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′，下游為5′-CGCUUCACGAAUUUGCGUGUCAU-3′。

1.6 HSC-T6細胞中Wnt/β-catenin信號通路蛋白檢測 將HSC-T6配置成1×105/mL的細胞懸液，以每孔1.5 mL接種于6孔板中；待細胞融合至80%左右，干預組每孔加入1.4篩選濃度的GLE 1.5 mL，對照組每孔加入等量含10%胎牛血清DMEM高糖培養基；每組設3個復孔，培育48 h。用含有PMSF的細胞裂解液提取總蛋白，采用Western blotting法以GAPDH為內參測算β-catenin、Frizzled-4蛋白表達量，以此表示信號通路活性。

1.7 統計學方法 采用GraphPad Prism7統計軟件。計量資料以表示，數據比較采用方差分析或t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GLE對HSC-T6細胞增殖的影響及作用時間、濃度篩選結果 由表1可見，隨著GLE濃度增加及干預時間延長，HSC-T6細胞增殖的OD值逐漸降低；與對照組比較，干預24 h時差異無統計學意義，干預48、72 h時差異具有統計學意義（P均＜0.05），故選擇48 h作為后續研究的作用時間。GLE組在稀釋200、100、50、25、10倍時，干預24 h的增殖抑制率分別為6.647%、5.766%、6.266%、6.997%、9.690%，干預48 h的細胞增殖抑制率分別為28.509%、51.695%、63.139%、65.763%、69.876%，干預72 h的細胞增殖抑制率分別為25.676%、43.266%、67.325%、82.339%、82.224%。GLE干預48 h時的IC50約為GLE稀釋100倍，后續實驗采用稀釋200倍為GLE作用濃度。

表1 GLE對HSC-T6細胞增殖的影響（）

表1 GLE對HSC-T6細胞增殖的影響（）

注：與對照組比較，*P＜0.05。

images/BZ_46_234_1605_1193_1664.png GLE組稀釋10倍稀釋25倍稀釋50倍稀釋100倍稀釋200倍對照組0.414±0.027*0.411±0.062*0.761±0.130*1.321±0.240*1.731±0.150*2.330±0.067 3.007±0.085 3.097±0.078 3.121±0.073 3.183±0.083 3.109±0.012 3.330±0.133 0.945±0.141*1.074±0.024*1.156±0.111*1.515±0.042*2.243±0.253*3.137±0.033

2.2 GLE對HSC-T6細胞活化的影響 干擾組HSC-T6細胞α-SMA、TGF-β1mRNA相對表達量分別為0.77± 0.23、0.86± 0.15，對照組均為1，干擾組α-SMA、TGF-β1mRNA表達均低于對照組（P均＜0.05）。

2.3 GLE對HSC-T6細胞Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達的影響 干擾組HSC-T6細胞Wnt/β-catenin信號通路蛋白Frizzled-4、β-catenin表達量分別為0.81±0.13、0.63±0.17，分別低于對照組的0.96± 0.16、0.84 ± 0.22（P均＜0.05）。

3 討論

肝纖維化是各種慢性肝損傷愈合反應后的結果，是一個損傷修復的動態過程。其特征在于不同因素（病毒、自身免疫、藥物誘導、膽汁淤積和代謝疾病等）引起的慢性肝損傷組織中ECM增多并伴有病理性血管新生［8-9］，可造成門靜脈高壓、肝脾腫大、肝功能紊亂甚至衰竭。慢性肝炎病毒感染和長期接觸有毒物質如乙醇等可誘發肝細胞壞死和細胞凋亡，細胞壞死和細胞凋亡會激活靜止HSC，觸發肝臟修復機制使ECM分泌增加，最終導致肝內纖維生成和降解失衡，過多的膠原在肝內沉積［3，10］。

HSC由靜息變為激活表型，由維生素A儲存細胞轉分化為增殖性、收縮性增加的肌成纖維細胞，活化HSC現已成為實驗和臨床肝纖維化干預的主要靶細胞［11］。在慢性肝損傷期間，HSC激活成表達α-SMA具有收縮性的肌成纖維細胞，HSC表型從脂肪儲存細胞轉變為肌成纖維細胞，脂滴逐漸減少或消失，細胞增殖和細胞收縮遷移能力增加，導致肝內血管扭曲和血管阻力增加，從而促進門靜脈高壓癥形成［12-13］。TGF-β有 TGF-β1、TGF-β2、TGF-β33 種同種亞型，是與ECM相關且研究最深入的細胞因子之一。TGF-β1是促進纖維化的主要因子，能夠通過跨膜受體發揮作用，可調節包括Ⅰ型、Ⅲ型前膠原在內的ECM分泌相關靶基因的轉錄［14］。因此，TGF-β1對HSC的活化作用是肝纖維化形成和發展的中心環節。在各種因素刺激下（肝炎病毒、乙醇、各種抗原等），TGF-β1/Smads信號通路可激活HSC并促進其分泌大量ECM沉積在肝臟［4-5］。另外，有研究表明，TGF-β1能夠介導Wnt/β-catenin信號通路的激活［15］，而經典Wnt/β-catenin信號通路的激活有調節細胞增殖、存活和細胞行為的功能。研究表明，Wnt/β-catenin信號通路在HSC的增殖、分化、分裂、遷移和凋亡中起重要作用。該通路的異常激活可誘導肝纖維化，阻斷Wnt/β-catenin信號通路是治療肝纖維化的關鍵方法之一［16-17］。β-catenin蛋白是經典Wnt/β-catenin信號通路的關鍵蛋白，在沒有Wnt信號的情況下其會被磷酸化并降解。然而，當Wnt蛋白與Frizzled家族蛋白和單個跨膜脂蛋白受體相關蛋白（LPR）5或6共受體的異二聚體受體復合物結合時，可導致下游蛋白β-catenin抑制復合體GSK-3、APC、CK1等的合成被抑制，β-catenin在胞質內大量累積，信號傳達到細胞核中與淋巴增強因子/T細胞因子（LEF/TCF）結合，進而影響細胞生命活動［7］。

靈芝為古稱的“九大仙藥”之一，最早的中藥典籍《神農本草經》中即有收載。靈芝中含有豐富的多糖、三萜類、肽類、核苷生物堿、氨基酸以及多種微量元素，是其產生臨床療效的重要物質基礎。靈芝及其提取物對多種有毒物質、免疫、缺血等因素造成的肝損傷均有抑制作用，在抑制肝纖維化、減輕脂肪肝形成等方面也具有良好的作用趨勢，還有一定的抗腫瘤、抗衰老、降血糖作用［18-19］。白靈芝又名白肉靈芝、玉芝，辛平無毒，主治咳逆上氣，益肺氣，通利口鼻，強志意，安魄。目前，市場上常見的白靈芝有云南白靈芝和西藏白靈芝［20］。朱優優［21］發現，白靈芝相較于赤靈芝、云靈芝等其他靈芝品種，具有更高的靈芝多糖含量。靈芝多糖是靈芝最主要的化學成分之一，具有抗腫瘤、免疫調節、降血糖、降血脂、抗氧化和抗衰老等多種功效［19］。

本研究結果顯示，與對照組比較，GLE組能不同程度抑制HSC增殖，抑制作用與作用時間及劑量有關。在慢性肝損傷期間，HSC激活成表達α-SMA具有收縮性的肌成纖維細胞，并分泌TGF-β1。本研究發現，GLE能在核酸水平下調α-SMA和TGF-β1的表達，表明其對于HSC的活化有一定的抑制作用。TGF-β1對HSC細胞ECM的分泌和活化有刺激作用，對TGF-β1的抑制能夠減緩肝纖維化的進程。此外，GLE還能下調Wnt/β-catenin信號通路活化，抑制關鍵蛋白β-catenin和Frizzled-4的表達，其對肝纖維化進程的抑制可能與此通路的阻斷有關，但其具體作用機制還需進一步探究。