GeneXpert MTB/RIF系統聯合抗酸涂片鏡檢在結核病診斷中的價值

李秋平，霍麗靜，張雪麗，幺建立，錢宇，趙運勝，張麗娜，楊丹丹

1秦皇島市第一醫院，河北秦皇島066000；2河北省人民醫院；3秦皇島市第三醫院

WHO最新數據顯示，我國的結核病發病率高達9%，耐藥結核病高達14%。非結核分枝桿菌（NTM）廣泛存在于自然界中，屬條件致病菌；其所致疾病與結核病癥狀相似，但治療不同。目前，缺乏準確和快速診斷仍然是我國結核病管理工作中的主要問題［1］。結核分枝桿菌（MTB）培養雖然特異性較高，但檢測周期長，嚴重影響臨床治療及患者預后；抗酸涂片鏡檢快速簡便，但靈敏度、準確度均較低。隨著分子生物學診斷技術的發展，越來越多的分子診斷技術被用于結核病診斷。GeneXpert MTB/RIF系統（簡稱Xpert）是一種核酸擴增技術［2］，具有簡單、快速、高靈敏度、高特異性等特點［3］。盡管2017年Xpert已被WHO認可，但我國尚未正式將其納入到常規結核病診斷和管理中［4］。目前，Xpert在國內已開始有相關報道，但鮮見其與抗酸涂片鏡聯合檢測的研究，本文探討了兩者聯合檢測在結核病診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年7月—2020年4月于秦皇島市第一醫院就診的疑似結核病患者638例，男394例，女244例；年齡12～103歲，其中青年112例、中年156例、老年370例；共收集標本638份，其中肺泡灌洗液264份、痰液211份、組織液81份、胸腹水48份、尿液14份、腦脊液13份、膿液7份；經MTB培養結果鑒定，陽性252份、陰性386份。本研究經醫院倫理委員會批準，受試者或其監護人均簽署知情同意書。

1.2 MTB快速檢測方法 所有標本同時行抗酸涂片鏡檢及Xpert檢測，均在二級生物安全柜內完成。采用美國Cepheid公司Xpert檢測系統和檢測試劑盒，按其操作規程進行檢測；抗酸涂片染色采用珠海貝索生物技術有限公司生產的抗酸染色液試劑盒，按照《痰涂片鏡檢與標準化操作及質量保證手冊》中的操作規程進行檢測，用Olympus光學顯微鏡鏡檢。聯合檢測用平行試驗（并聯試驗），凡有一項指標陽性即判為陽性，全部結果均陰性才為陰性。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。以MTB培養結果為參考，評價Xpert、抗酸涂片鏡檢單獨與聯合的診斷價值；計數資料以百分比表示，數據比較行χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義；分析三種方法與MTB培養結果診斷的一致性，Kappa≥0.75表示一致性較好、0.4～＜0.75表示一致性一般、＜0.4表示一致性較差。

2 結果

2.1 Xpert檢測與抗酸涂片鏡檢結果 Xpert檢測陽性245份（MTB培養陽性232份、陰性13份），陰性393份（MTB培養陽性20份、陰性373份）；抗酸涂片鏡檢陽性86份（MTB培養陽性62份、陰性24份），陰性552份（MTB培養陽性190份、陰性362份）。

2.2 Xpert檢測、抗酸涂片鏡檢單獨與聯合檢測診斷效能比較 Xpert檢測、抗酸涂片鏡檢與Xpert聯合檢測的靈敏度、準確度、陽性預測值、陰性預測值均高于抗酸涂片單獨檢測（P均＜0.05），聯合檢測與Xpert單獨檢測差異均無統計學意義。Xpert檢測、抗酸涂片鏡檢單獨與聯合檢測的約登指數分別為88.7、18.4、91.3，與 MTB培養結果診斷的一致性Kappa分別為0.891、0.208、0.909，聯合檢測的約登指數、Kappa值均高于單獨檢測。見表1。

表1 Xpert檢測、抗酸涂片鏡檢單獨與聯合檢測對結核病的診斷效能

3 討論

結核病作為我國重大傳染病之一，一直危害著人類的健康。近年來，我國新發的耐藥肺結核每年約12萬例，與普通肺結核相比，耐藥結核病傳染性高、治愈率低、治療時間長，給結核病的防控工作帶來新的挑戰［2］。一線抗結核藥物治療中，利福平耐藥是治療失敗的主要原因，且MTB極易對利福平耐藥，一旦出現利福平耐藥會給臨床治療帶來困難［5］。因此，快速準確診斷結核病，對降低結核病病死率，改善患者預后，節約醫療資源，降低傳播風險至關重要。

目前臨床診斷結核病主要依靠實驗室檢查，包括傳統的抗酸涂片鏡檢和細菌培養及藥敏鑒定實驗。抗酸涂片鏡檢對菌量要求高，靈敏度低，要求菌量達（5～10）×103/mL才能檢出，因此涂片鏡檢陽性檢出率僅30%左右，尤其是腦脊液、胸腹水等無菌標本更易漏診；而且，該方法不能區分MTB和NTM，尤其近幾年來NTM比例有上升趨勢，因此該法對結核病的診斷會造成一定困擾；另外，該法不能區分死菌和活菌，不利于疾病的治療及預后判斷。MTB培養及藥敏鑒定耗時較長（傳統的羅氏培養和比例法藥敏需要8周，MGIT液體培養和藥敏試驗至少需要5周），對送檢樣本的時間、容器等質量要求較高，且必須是活菌，操作繁瑣，對生物安全要求較高。因此，以上兩種方法均不能滿足臨床快速診斷的需求，尋找一種高靈敏度和高特異度的檢測方法迫在眉睫［6］。

Xpert檢測技術是近年新興的分子診斷方法，其采用全自動熒光定量PCR技術，將約2 mL檢測標本置入試劑盒中，樣品自動前處理釋放出MTB DNA，自動擴增檢測，實現了真正的封閉系統，樣品盒和儀器之間不存在濕式接觸，擴增和檢測同時進行，適用于多種類型的標本檢測，且消除了污染。該技術通過對MTB特有的rpo B基因作為靶基因設計引物和探針（探針A、B、C、D、E）以獲得檢測結果，具有較高的靈敏度和特異度。由于95%利福平耐藥菌株均由rpo B基因突變（81 bp的核心區域RRDR）造成，因此該方法可在2 h內完成對MTB和利福平的耐藥性測定［7-9］。本研究共252例患者確診結核病，Xpert檢測的靈敏度為92.1%、特異度為96.6%、準確度為94.8%，均明顯高于抗酸涂片鏡檢，且與MTB培養具有較高的一致性，與國內報道的靈敏度和特異度較接近。這說明Xpert檢測技術可以幫助臨床精準快速診斷結核病，減少一定的誤診率和漏診率［9-10］。

Xpert檢測技術作為一個獨立的PCR檢測系統，對實驗室生物安全和環境要求相對較低，對生物安全防護級別要求與抗酸涂片鏡檢相當，對實驗人員要求也較低［11］。本研究將這兩種快速檢測方法進行了聯合檢測，結果顯示聯合檢測的靈敏度、準確度和約登指數較抗酸涂片單獨檢測明顯提高，較Xpert單獨檢測有所提高但差異不顯著。分析其原因可能是Xpert自身已經具有較高的靈敏度和特異度，理想狀態的靈敏度和特異度是100%，而Xpert已經達到92.1%和96.6%，可提升的空間已經很小，所以聯合檢測并沒有顯示出明顯的優勢，同時也證明了Xpert確實是一種快速準確診斷結核病的較好方法。另外，本研究僅對252例結核病患者進行了初步研究，確切的結論有待于后續多中心、大樣本量的統計分析。由于Xpert對MTB有特異性，對NTM無特異性，因此聯合檢測時抗酸涂片鏡檢陽性同時Xpert陰性者，理論上高度懷疑NTM感染，同時Xpert陽性基本可排除NTM感染［12］。有報道顯示，抗酸涂片鏡檢陽性Xpert陰性與培養診斷NTM有較高的一致性，可早期篩檢出90%以上的NTM患者，提高了診斷的時效性［13］。因此，聯合檢測對輔助診斷NTM具有一定意義。

Xpert作為一個高靈敏度、高特異度的分子診斷技術，在早期診斷結核病的領域將越走越廣，已經被應用到診斷各類結核病中，常聯合超聲、CT、病理等方法診斷骨結核、腸結核、胸膜結核等。另外，有研究報道Xpert對利福平的耐藥也能快速檢測出來，優于傳統的方法，因此Xpert在檢測利福平耐藥方面的臨床價值更高［14］。同時《兒童結核病管理指南》推薦Xpert用于診斷兒童結核病，針對兒童疑似結核病、耐多藥結核病以及兒童結核性腦膜炎腦脊液的檢測，Xpert可先于傳統方法（涂片、培養）作為初篩實驗使用［15］。

綜上所述，Xpert診斷結核病具有較高的靈敏度和特異度，明顯優于單獨抗酸涂片鏡檢；Xpert聯合抗酸涂片檢測沒有明顯提高Xpert的診斷效能，但對NTM輔助診斷可能具有一定意義。