轉錄組學解析茉莉酸甲酯對雙孢蘑菇個體大小的影響機制

宋 媛，胡秋輝，蘇安祥，裴 斐，馬高興，馬 寧，楊文建

（南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇 南京 210023）

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）又稱白蘑菇、洋蘑菇、紐扣蘑菇等，富含維生素、甘露醇等營養物質，具有低脂肪、低能量、高蛋白的特征，是一種典型的菌類保健食品[1-2]。雙孢蘑菇是世界上種植最廣泛的食用菌，也是市場上最常見的食用菌，在我國雙孢蘑菇的消費量和出口量較大，經濟收益十分可觀[3]。通過適宜的栽培條件，可提高雙孢蘑菇品質，增加經濟效益。趙志順等[4]的研究證明泥炭覆土可改善雙孢蘑菇品質，由于改變栽培條件操作復雜，增加了原料成本及勞動力，尋找一種新型、簡便、經濟的提高雙孢蘑菇品質的方法并研究其作用機理具有重要意義。

近年來，外源噴施茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）成為一種新興的改善作物品質的方式。MeJA是植物體內廣泛存在的天然化學物質，其外源應用能調節植物的生長發育[5]，也能激發防御植物基因的表達[6]。MeJA作為新型植物調節物質，近年來被廣泛用于園藝作物和農作物的品質優化中。外源噴施MeJA可增大香蕉李的果實大小和質量[7]，可提高不同灌溉條件下的2 個面包小麥品種的穗粒數、千粒質量和籽粒產量[8]，以及增加香雪蘭的小花數和提高植株高度[9]。對于雙孢蘑菇品質的提高，過去主要采取改良覆土層的方式實現，通過外源噴施MeJA的方式鮮見報道。在前期MeJA外源噴施處理對雙孢蘑菇采后保鮮的研究中[10]，發現菇蕾期噴施MeJA提高雙孢蘑菇采后保鮮品質的同時還能促進雙孢蘑菇個體增大，因此MeJA可作為雙孢蘑菇的新型品質優化劑，探究MeJA促進雙孢蘑菇個體增大的機理具有重大意義。

轉錄組學技術因其具有低成本、高通量、重復性好、精確度高以及操作簡單等優點，被廣泛用于差異表達基因的研究。張艷艷等[11]利用轉錄組測序技術揭示了西瓜噬酸菌2 個不同菌株與寄主甜瓜幼苗互作在轉錄水平上的表達差異，明確了CaM、Rboh、CDPK、FLS2等基因在西瓜噬酸菌與寄主之間早期互作的重要性。吳小梅[12]利用轉錄組學測序技術，對3 個不同發育時期的雙孢蘑菇子實體進行測序和Pathway功能富集分析，篩選得到的差異基因主要富集在核苷酸代謝、脂類代謝、能量代謝、碳水化合物代謝和氨基酸代謝這5大代謝通路中，包括激酶蛋白、信號受體蛋白以及一些轉錄調控活性蛋白等酶類蛋白，表明雙孢蘑菇子實體發育形成需要一系列代謝反應協同調控以及各類轉錄因子基因的表達調控。邊小禹等[13]通過轉錄組學分析挖掘了3 個不同發育時期的豬苓菌核中有關防御、跨膜運輸、極性生長、形態發育、細胞壁合成、黑色素合成、藥效成分麥角甾醇和豬苓多糖合成功能的差異表達基因，根據差異表達基因通路富集注釋進一步推測出豬苓菌核的發育成熟機制。因此，利用轉錄組學測序技術研究探索MeJA促進雙孢蘑菇個體增大的基因具有重要的意義。

本研究以雙孢蘑菇為材料，采用不同濃度的MeJA溶液采前噴施處理，篩選得到能使雙孢蘑菇個體增大的MeJA濃度，并結合轉錄組學分析研究MeJA處理促進雙孢蘑菇個體增大的作用機制，為MeJA促進雙孢蘑菇的個體增大提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究選用的雙孢蘑菇栽培、采摘于江蘇紫山生物股份有限公司（江蘇淮安）。

MeJA（純度95%） 美國Sigma公司；無水乙醇（分析純） 南京化學試劑有限公司；細胞色素P450氧化酶ELISA檢測試劑盒、木葡聚糖內轉糖苷酶/水解酶ELISA檢測試劑盒、內切-β-1,4-葡聚糖酶ELISA檢測試劑盒 南京立奧生物科技有限公司。

MeJA溶液配制：向2%乙醇溶液分別添加MeJA，配制濃度分別為10、50、100、150、200 μmol/L的MeJA溶液。

1.2 儀器與設備

HWS-280恒溫恒濕培養箱 寧波江南儀器設備有限公司；CS501-SP數顯恒溫振蕩水浴鍋 重慶四達試驗儀器有限公司；M2E型多功能酶標測試儀 美國BioTek公司；Allegra系列冷凍離心機、Allegra 64R臺式離心機美國Beckman Coulter公司；Gel DOCXR凝膠成像分析系統 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

設置超純水為空白組、2%乙醇溶液為乙醇組，不同濃度的MeJA溶液為處理組，每組處理設置3 床雙孢蘑菇。當雙孢蘑菇處于出菇期第4天（菇蕾直徑=（9.77f 0.16）mm）時，將不同處理組的溶液以30 mL/m2均勻噴灑于雙孢蘑菇表面。自噴菇之日起，每天采摘雙孢蘑菇，連續采收4 d，直至達到雙孢蘑菇采收期（噴施處理后第3天）。選擇菇體完整、無機械損傷和病蟲危害的雙孢蘑菇，隨機取同一處理組雙孢蘑菇10 個左右分離菌傘、菌柄，將菌傘和菌柄分別混合作為一組樣品，再進行相同操作2 次，每種處理取3 組樣品作為平行樣。將所有樣品液氮冷凍，置于-80 ℃冰箱中保存備用。

1.3.2 指標測定

1.3.2.1 雙孢蘑菇大小及質量測定

從各個處理組樣品中隨機取10 個雙孢蘑菇，測量菌傘直徑、厚度，并稱質量。篩選出最佳促雙孢蘑菇個體增大的MeJA濃度，并選用個體增大最顯著的處理組進行后續研究。

1.3.2.2 細胞色素P450氧化酶、木葡聚糖內轉糖苷酶/水解酶及內切-β-1,4-葡聚糖酶活力測定

分別采用細胞色素P450氧化酶ELISA檢測試劑盒、木葡聚糖內轉糖苷酶/水解酶ELISA檢測試劑盒和內切-β-1,4-葡聚糖酶ELISA檢測試劑盒對雙孢蘑菇菌傘進行酶活力測定。

1.3.2.3 總RNA的提取與測序文庫的構建

選擇第0天和第1天的雙孢蘑菇菌傘進行轉錄組學測序。用Trizol試劑提取總RNA，取雙孢蘑菇樣品0.1 g，在液氮中充分研磨至粉末后置于1.5 mL離心管中，加入1 mL Trizol抽提液。室溫下放置5～10 min后，12 000 r/min離心15 min，取上清液并加入1/5體積的氯仿，劇烈振蕩15 s后在冰上放置5 min；12 000 r/min離心15 min，取上清液于另一離心管中，加入等體積異丙醇并上下顛倒混勻，在冰上放置15～20 min；12 000 r/min離心15 min后棄去上清液。將沉淀用1 mL 75%乙醇溶液清洗2 次，并于4 ℃、7 500 r/min離心10 min，棄去上清液，室溫下干燥1～2 min即得樣品總RNA。利用凝膠成像系統和酶標儀檢測RNA的質量。完整的RNA具有3 條明顯的條帶，28S、18S和5S rRNA，且28S條帶是18S條帶亮度的2 倍。測定RNA的濃度和OD260nm/OD280nm值，RNA的OD260nm/OD280nm值介于1.8和2.1之間[14]。樣品檢測合格后，由上海歐易生物醫學科技有限公司完成cDNA文庫的構建及高通量測序。

1.3.2.4 轉錄組學數據分析

高通量測序中產生的原始數據（raw reads）為fastq格式序列。為了得到可進行后續分析的高質量reads，需進一步對raw reads進行質量過濾。采用Trimmomatic[15]軟件進行質控并除去接頭，在此基礎上過濾掉低質量的堿基和N堿基，得到高質量的數據。使用hisat2[16]將clean reads比對到物種的參考基因組，軟件參數為默認參數，通過基因組的比對率評估樣本的情況（雙孢蘑菇基因組網址：ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/300/575/GCF_000300575.1_Agabi_varbisH97_2/GCF_000300575.1_Agabi_varbisH97_2_genomic.fna.gz）。

Clean reads與參考基因組比對的結果，以二進制binary文件進行儲存。基因FPKM表達量值采用cufflinks[17]軟件定量。在計算基因表達量的差異時，利用htseqcount[18]軟件得到落到各個樣本中基因的reads數目，使用DESeq(2012)R package[19]的estimateSizeFactors函數對數據進行標準化，并使用nbinom Test函數計算差異比較的P值和Fold Change值。挑選出Fold Change大于2、P值小于0.05的差異基因，并進行差異基因的基因本體（gene ontology，GO）[20]富集分析，以判定差異基因的功能。

1.4 數據處理

雙孢蘑菇個體大小及質量測定設置10 組平行，其余指標的測定設3 組平行，在熒光定量結果分析時，設內參基因的表達值為1。采用Origin 8.5.1軟件進行數據處理和作圖，JMP 10軟件進行數據統計分析，利用Duncan法進行多重分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 MeJA處理對雙孢蘑菇個體大小的影響

表1 不同處理對雙孢蘑菇個體大小的影響Table 1 Effect of different treatments on the size of A.bisporus

由表1可知，與對照組相比，50 μmol/L MeJA能顯著促進雙孢蘑菇個體增大。在噴施MeJA后的第1天，經50 μmol/L MeJA處理的雙孢蘑菇平均單菇質量、菌傘直徑和菌傘厚度均顯著高于其他組（P＜0.05），其中平均單菇質量約為其他組雙孢蘑菇的2 倍。處理后第2天，50 μmol/L MeJA處理的雙孢蘑菇平均單菇質量和大小仍顯著高于其他組（P＜0.05），且基本達到采收期的大小。處理后第3天，各組雙孢蘑菇均達到采收期大小，無顯著差異。結果表明50 μmol/L MeJA能促進雙孢蘑菇的個體增大，使雙孢蘑菇提前1 d生長至采收期大小。因此本研究促進雙孢蘑菇個體增大的最佳MeJA濃度為50 μmol/L，后續結果分析中的MeJA處理均指代50 μmol/L MeJA處理。

2.2 MeJA處理對雙孢蘑菇生長相關酶活力的影響

圖1 不同處理對雙孢蘑菇細胞色素P450氧化酶（A）、木葡聚糖內轉糖苷酶/水解酶（B）和內切-β-1,4-葡聚糖酶（C）活力的影響Fig.1 Effect of different treatments on the activities of cytochrome P450 oxidase (A), xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase (B) and endo-β-1,4-glucanase (C) in A.bisporus

由圖1可知，經50 μmol/L MeJA噴施處理后，雙孢蘑菇中細胞色素P450氧化酶活力在第1、3天顯著增加（P＜0.05），第2天酶活力與其他組相比無顯著差異。MeJA處理對雙孢蘑菇中木葡聚糖內轉糖苷酶/水解酶活力并無明顯的調控趨勢。3 組雙孢蘑菇樣品中內切-β-1,4-葡聚糖酶活力在處理后第1天無顯著差異，第2天處理組酶活力顯著高于空白組和乙醇組（P＜0.05）。因此，MeJA可能通過誘導增加細胞色素P450氧化酶、內切-β-1,4-葡聚糖酶的活力促進雙孢蘑菇的個體增大。

2.3 轉錄組學測序數據統計

表2 樣品測序產出數據質量評估情況Table 2 Quality assessment of sequencing output data of samples

由表2可知，對雙孢蘑菇不同處理的樣本進行轉錄組學測序，獲得的原始片段均高于48×106，對原始數據進行質量預處理后，對整個質控過程中的reads數進行統計匯總得到超過45×106的剩余片段，且有效基數均高于89%。4 組樣本的平均Q30值分別為91.49%、91.77%、92.29%和90.99%，平均GC相對含量分別為49.91%、49.93%、49.87%和49.87%。由此可見，轉錄組測序得到的數據數量和質量都較高，達到標準，可用于后續研究分析。

2.4 與參考基因組比對分析

表3 Reads與參考基因組比對情況Table 3 Results of reads mapping to the reference genome

為了檢查測序得到的基因文庫是否滿足后續基因表達的計算，將有效序列與指定的參考基因組進行序列比對，獲取在參考基因組或基因上的位置信息，以及測序樣品特有的序列特征信息。由表3 可知，轉錄組測序獲得的有效序列中，能定位到基因組上的序列片段占比均在92.97%～94.34%范圍內。在參考序列上，具有多個比對位置的序列片段占比均在0.98%～1.18%范圍內；具有唯一比對位置的序列片段占比在91.79%～93.36%范圍內；比對到基因組上正鏈的序列片段占比在45.88%～46.67%范圍內，比對到負鏈上的序列片段占比均在45.91%～46.69%范圍內。定位到基因組上的序列片段中，能整段比對到外顯子占比在53.28%～55.08%范圍內，分段比對到外顯子占比在38.22%～39.12%范圍內。該結果表明所有文庫基本檢測到了組織內所有表達的基因，滿足后續基因的表達計算。

2.5 差異基因整體分布情況分析

圖2 CT1 vs CK（A）、ET1 vs CK（B）、MJ1 vs CK（C）差異基因表達MA圖Fig.2 MA plots of differentially expressed genes in CT1 vs CK (A),ET1 vs CK (B) and MJ1 vs CK (C)

通過MA圖[21]可以了解差異表達基因的整體分布情況。如圖2所示，在3 個對比處理組中，MJ1 vs CK組的顯著差異基因最多。CT1與CK比較，共篩選得到267 個差異基因，其中上調基因134 個，下調基因133 個；ET1與CK比較，共篩選得到243 個差異基因，其中上調基因93 個，下調基因150 個；MJ1與CK比較，共篩選得到525 個差異基因，其中上調基因212 個，下調基因313 個。結果表明經50 μmol/L MeJA處理后，雙孢蘑菇中基因變化差異最大，這種變化可能與雙孢蘑菇更快速的生長活動相關，說明MeJA通過影響基因的差異表達促進雙孢蘑菇的個體增大。

2.6 差異基因GO富集分析

GO富集分析可以為基因產物提供三類描述，即生物過程、細胞成分和分子功能，通過差異基因的GO富集分析，可研究基因的功能，如圖3所示，在3 個對比處理組中，CT1 vs CK、ET1 vs CK和MJ1 vs CK中的總上調和下調差異表達基因數分別為64和46、44和53、95和126。在生物過程這一功能分類中，3 組處理中大多數差異表達基因都富集在細胞過程條目，其中，MJ1 vs CK組中有52 個上調基因和54 個下調基因，顯著多于CT1 vs CK組中的38 個上調基因、18 個下調基因和ET1 vs CK組中的21 個上調基因和21 個下調基因。在細胞成分分類中，MJ1 vs CK組中有59 個上調基因和68 個下調基因富集在細胞這一條目，而CT1 vs CK組中只有43 個上調基因和23 個下調基因、ET1 vs CK組中25 個上調基因和27 個下調基因富集在該GO條目。分子功能中催化活性這一GO條目包含了大多數差異表達基因，其中MJ1 vs CK組中有69 個上調基因和84 個下調基因，多于CT1 vs CK組中48 個上調基因和32 個下調基因以及ET1 vs CK組中32 個上調基因和38 個下調基因。這些基因功能都與雙孢蘑菇的生長代謝相關，說明MeJA可以通過影響以上GO條目中基因的差異表達促進雙孢蘑菇的個體增大。

2.7 雙孢蘑菇個體增大相關基因篩選

表4 雙孢蘑菇個體增大相關基因篩選結果Table 4 Screening results of genes related to the size of A.bisporus

從基因文庫中篩選表達差異最顯著的部分基因，見表4。篩選得到的基因多為未注釋的基因，且多為下調表達，僅基因AGABI2DRAFT_43781和A G A B I 2 D R A F T_1 3 8 3 4 3 上調表達。其中基因AGABI2DRAFT_136361與疏水蛋白的形成有關；基因AGABI2DRAFT_188444與鋅金屬蛋白酶的編碼相關；基因AGABI2DRAFT_194024參與編碼細胞色素P450單加氧酶；基因AGABI2DRAFT_43781與非特異膜蛋白形成相關。該篩選結果表明MeJA可以通過影響以上基因的差異表達來促進雙孢蘑菇的個體增大。

圖3 CT1 vs CK（A）、ET1 vs CK（B）、MJ1 vs CK（C）差異基因GO富集結果Fig.3 GO enrichment analysis of differentially expressed genes in CT1 vs CK (A), ET1 vs CK (B) and MJ1 vs CK (C)

3 討論與結論

本研究結果表明50 μmol/L MeJA能促進雙孢蘑菇個體增大，提前1 d達到采收期大小。與以往在覆土層中添加一定量的豆粕[22]、石灰石[23]或惡臭假單胞菌[24]等提高雙孢蘑菇品質的方式相比，外源噴施MeJA簡化了生產過程，同時，每1 m2菇床只需要噴施0.327 μL MeJA，減少了原料投入，提高了經濟效益。

雙孢蘑菇生長過程中，處理組細胞色素P450氧化酶活力在第1、3天顯著高于空白組和乙醇組，內切-β-1,4-葡聚糖酶活力在第2天顯著高于其他組。楊杰等[25]指出細胞色素P450單加氧酶（CYP450）是植物代謝過程中最大的酶家族，參與三萜和甾醇骨架結構的多樣化以及功能修飾，三萜類化合物和甾醇在植物的生長發育過程中發揮著重要作用。戴永國等[26]研究表明細胞色素P450家族酶參與很多與發育相關的內源性物質的代謝，進而影響機體的生長發育。內切-β-1,4-葡聚糖酶是一種纖維素酶，可以從多種材料中消化纖維素，如纖維素、β-1,4-葡聚糖[27]。張新富等[28]研究發現，內切-β-1,4-葡聚糖酶與茌梨果實生長發育有關。內切-β-1,4-葡聚糖酶能夠促進組織的快速生長以及果實的成熟[29]。因此MeJA可能通過誘導增加細胞色素P450氧化酶、內切-β-1,4-葡聚糖酶活力，促進雙孢蘑菇的個體增大。

雙孢蘑菇的生長由很多基因決定。有研究表明hypB基因、ATP合成酶亞基編碼基因AtpD和隔膜蛋白編碼基因SepA對雙孢蘑菇子實體的良好發育具有重要作用[30]；翻譯延長因子1a基因對維持雙孢蘑菇成熟細胞的形態具有重要作用，C2H2型鋅指蛋白、真菌特異性轉錄因子、熱激蛋白轉錄因子hsf1[12]；疏水蛋白基因hypA、脲酶基因及起滲透調節作用的甘露醇脫氫酶基因參與了雙孢蘑菇子實體的形成過程[31-32]。本研究采用轉錄組學技術研究50 μmol/L MeJA對雙孢蘑菇個體的促增大作用，檢測到雙孢蘑菇生長過程中富集在細胞過程、細胞、催化活性等GO條目中的上調和下調表達基因數目均顯著增加，這些功能條目均與生長發育相關，結果表明MeJA通過影響這些GO條目中基因的差異表達促進雙孢蘑菇的個體增大。從差異基因中篩選的差異最顯著部分基因中，有功能注釋的基因AGABI2DRAFT_136361、AGABI2DRAFT_188444、AGABI2DRAFT_194024和AGABI2DRAFT_43781分別與疏水蛋白、鋅金屬蛋白酶、細胞色素P450單加氧酶和非特異膜蛋白的形成相關。疏水蛋白參與真菌許多形態發生過程，包括分生孢子萌發、子實體發育[33]。含鋅金屬蛋白酶可參與調控多種細胞內物質的活動，如調節纖維素的沉積[34]，進而影響機體組織等的發育[35]。細胞色素P450單加氧酶可在植物發育過程中發揮著特異性調節作用[36]。膜脂結構存在許多膜蛋白，包括各種酶、蛋白轉位酶復合物以及許多轉運蛋白，在生物體細胞的增殖和分化、能量轉換、信號轉導及物質運輸等許多生命活動中起著非常重要的作用[37]。這些基因都參與雙孢蘑菇的生長發育，均與雙孢蘑菇的生長發育相關，說明MeJA可能通過調控這些差異基因的表達促進雙孢蘑菇的個體增大。通過轉錄組學技術能更深入、全面地從整體水平上研究細胞中基因轉錄的情況及轉錄調控規律，這也為后續進一步差異基因的功能驗證、差異基因受MeJA調控在雙孢蘑菇生長期間的功能解析及MeJA促進雙孢蘑菇個體增大調控網絡的精確描繪提供了理論依據。

因此，50 μmol/L MeJA能促進雙孢蘑菇的個體增大，導致雙孢蘑菇個體增大的原因可能是50 μmol/L M e J A 處理后，雙孢蘑菇生長過程中一些基因的表達、生長代謝活動以及一些酶活力受到調控。其中與生長相關的基因A G A B I 2 D R A F T_1 3 6 3 6 1、AGABI2DRAFT_188444和AGABI2DRAFT_194024下調表達，基因AGABI2DRAFT_43781上調表達；富集在細胞過程、細胞、催化活性等與生長發育相關的GO條目中的上調和下調表達基因數目顯著增加；與生長發育相關酶細胞色素P450氧化酶和內切-β-1,4-葡聚糖酶活力顯著增加。