miR-186-5p與α-MSH互作對綿羊黑素細胞黑色素生成的影響

許冬梅，朱芷葳，唐中偉，李鵬飛，董常生，趙宇軍

(1.山西農業大學生命科學學院，太谷 030801； 2.山西農業大學動物醫學學院，太谷 030801)

皮膚是人體的第一道屏障，具有重要的保護功能，其中黑素細胞產生的皮膚色素除了可以對抗高溫和吸收紫外線外，還具有抗氧化劑和清除自由基的作用，黑色素由黑素細胞中的細胞器黑素體產生。黑色素的生成、轉運和沉著除了由遺傳物質決定外，還受環境和內分泌調節的影響[1]。酪氨酸酶(tyrosinase， TYR)、酪氨酸酶相關蛋白1(tyrosinase related protein 1, TYRP1)和酪氨酸酶相關蛋白2(tyrosinase related protein 2, TYRP2)是催化黑色素生成的關鍵因子，其中TYR是限速酶[2]。小眼畸形相關轉錄因子(microphthalmia-associated transcription factor，MITF)是調控黑色素形成關鍵酶的重要轉錄因子[3]。促黑素細胞激素 (alpha-melanocyte stimulating hormone, a-MSH)是一種神經內分泌激素，由皮膚的黑素細胞和角化細胞合成和分泌[4]，α-MSH與黑素皮質素受體1(melanocortinreceptor-1, MC1R)結合是皮膚色素合成與沉著起始的關鍵步驟，二者的結合不僅能激活和提高TYR的酶活性，上調其表達，促進真黑素的生物合成[5]，還能促進黑素細胞樹突的形成，使黑素小體更易轉運到角化細胞，促進黑色素的沉著[6]。a-MSH/MC1R是黑色素生成的主要信號通路，可通過上調MITF的表達促進TYR、TYRP1和TYRP2 的表達，進而促進黑色素的合成[7]。

據報道，大約98%的基因組被轉錄為非編碼RNA[8]，microRNAs (miRNA, miR) 是大約18～25個堿基對的非編碼單鏈RNA分子，主要在轉錄后水平上對基因表達發揮調節功能，通常miRNA與靶標基因的3′-非翻譯區(UTR)不完全結合，抑制靶標基因蛋白質的翻譯，其功能涉及細胞增殖、細胞分化、細胞凋亡、血管生成以及癌癥和糖尿病等疾病的進程[9]，如miR-186與細胞的增殖、分化和凋亡有關，且在各種癌癥組織中表達異常，具有類似抑癌基因的作用，研究表明，miR-186與多種癌細胞和黑色素瘤細胞的增殖和遷移有關[10-13]。近年來發現，miRNAs與黑色素的生成和皮膚的色素沉著有關，且一些miRNAs如miR-25、miR-137、miR-145、miR-148-3p、miR-218等通過調控MITF參與毛色形成[14-17]，許冬梅等[18]也發現，miR-186可能通過調控MITF影響綿羊黑素細胞的增殖、遷移和黑色素的合成。

一般對miRNA的研究都與其靶基因聯系在一起，而且miRNA都是負調控其靶標基因的表達，本研究為了揭示miR-186-5p與α-MSH共同作用對綿羊黑素細胞及黑色素生成的影響，在綿羊黑素細胞中轉染miR-186-5p，同時添加α-MSH因子使二者共同作用綿羊黑素細胞，為更深入地探討miRNAs 的調節作用提供有力的理論依據。

1 材料與方法

1.1 載體構建與引物合成

本試驗所用真核表達載體為帶有綠色熒光蛋白的pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR (Invitrogen)載體，包括miR-186-5p表達載體和陰性對照(negative control, NC)表達載體。所用引物均由北京六合華大公司合成，所有引物序列見表1。綿羊黑素細胞系由本實驗室分離鑒定培養。

表1 目的基因引物序列Table 1 Primer sequences of target genes

1.2 主要試劑和儀器

反轉錄PCR試劑盒(TaKaRa, 大連)，Trizol試劑(Invitrogen，美國)，黑素細胞培養基(ScienCell，美國)，RIPA裂解液(碧云天，上海)，SYBR Prime Script TMRT PCR KIT (TaKaRa，大連)，TYR抗鼠多克隆抗體(abcam，美國)，TYRP1抗鼠多克隆抗體(abcam，美國)，TYRP2抗鼠多克隆抗體(abcam，美國)，MITF抗鼠多克隆抗體(Thermo，美國)，抗 β-actin 兔多克隆抗體(CWBIO，北京)，質粒中提試劑盒(QIAGEN，美國)；高速低溫冷凍離心機(Sigma，德國)，超凈工作臺(SW-CJ-CO，蘇州)，7500 Fast Real time PCR System(Life technologies，美國)，核酸蛋白測定儀(Thermo，美國)。

1.3 黑素細胞的復蘇、轉染、添加與劃痕處理

液氮中取出保存的綿羊黑素細胞，在37 ℃預熱的水浴中溶解復蘇后接種于6孔培養板中， 37 ℃、5% CO2培養24 h更換培養基，細胞密度長到80%左右時進行轉染、添加與劃痕處理[18]。

試驗共分為3組，分別為miR-86-5p組(綿羊黑素細胞中轉染miR-86-5p真核表達載體)、陰性對照組(negative control,NC,轉染NC真核表達載體)、miR-86-5p+α-MSH互作組(黑素細胞中轉染miR-86-5p的同時添加α-MSH，α-MSH的添加濃度為10-9mol·L-1[19])。

1.4 qRT-PCR檢測相關基因mRNA表達水平

收集轉染、添加后培養48 h的綿羊黑素細胞，通過Trizol法提取細胞總RNA，使用反轉錄試劑盒反轉錄獲得cDNA，根據NCBI上發布的序列設計綿羊MITF、TYR、TYRP1、TYRP2與18S的qRT-PCR擴增引物(表1)，以濃度統一后的cDNA為模板，按照熒光定量試劑盒說明進行qRT-PCR擴增，每個樣品重復3次。

1.5 Western blotting檢測相關蛋白質表達水平

收集轉染、添加后培養48 h的黑素細胞，使用蛋白提取試劑盒提取綿羊黑素細胞總蛋白，各組蛋白濃度統一后進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，5%脫脂牛奶封閉轉到NC膜上的蛋白質1 h，然后，將載有蛋白質的NC膜放入抗體孵育盒中一抗孵育4 ℃過夜，第2天TBST緩沖溶液洗滌NC膜3次，37 ℃搖床孵育二抗1 h，TBST洗滌3次，最后，通過Ecl發光液試劑盒，在凝膠成像系統中蛋白條帶掃描成像。

1.6 分光光度法測定黑色素含量

轉染、添加后培養48 h的黑素細胞PBS (磷酸緩沖液)洗滌3次，0.25%胰酶消化，PBS混懸細胞，取其中一部分細胞懸液進行細胞計數，剩余部分加入0.2 mol·L-1NaOH裂解液，在80 ℃金屬浴中裂解5～10 min，細胞裂解液加入96孔的酶標板中，酶標儀測量475 nm 波長時的吸光值，最后根據吸光值和細胞計數值計算各組細胞的黑色素含量(μg/106個細胞)。

1.7 免疫組織化學檢測MITF的表達與定位

轉染、添加后培養48 h的黑素細胞PBS (磷酸緩沖液)洗滌3次，4%多聚甲醛固定30 min，3% H2O2孵育10 min去除內源性過氧化酶，血清封閉液中37 ℃孵育30 min，一抗稀釋液中4 ℃靜置孵育過夜(陰性對照PBS緩沖液代替一抗)，次日復溫后去除一抗，37 ℃恒溫箱中二抗孵育30 min，避光條件下DAB顯色，最后顯微鏡觀察、拍照。

1.8 統計學分析

所有試驗重復3次以上，利用SPSS 19.01進行統計分析，數據間比較使用單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著具有統計學意義。

2 結 果

2.1 miR-186-5p與α-MSH對相關基因轉錄水平的影響

收集并提取各試驗組細胞總RNA，并反轉錄獲得cDNA，以cDNA為模板通過qRT-PCR檢測各試驗組TYR、TYRP1、TYRP2和MITF基因轉錄水平的差異。結果顯示，miR-186-5p轉染組中，4種基因的轉錄水平均有所下降，分別為對照組的31.1%(TYR)、38.4%(TYRP1)、57.5%(TYRP2)和24.7%(MITF)(圖1)，其中，TYR和MITF基因表達極顯著下降(P<0.01)，TYRP1表達顯著下降(P<0.05)。但當miR-186-5p和α-MSH同時存在時，4種基因轉錄水平的下調趨勢均有所減緩但未恢復到對照水平，分別為對照組的70.5%(TYR)、84.4%(TYRP1)、68.9%(TYRP2)和68.3%(MITF)，說明α-MSH緩解了miR-186-5p對TYR、TYRP1、TYRP2和MITF表達的抑制作用。

*. P<0.05, **. P<0.01，***.P<0.001。下同*. P<0.05, **. P<0.01，***.P<0.001. The same as below圖1 miR-186-5p轉染組、miR-186-5p+α-MSH互作組和對照組中TYR、TYRP1、TYRP2 和MITF mRNA相對表達量Fig.1 Relative expression levels of mRNA for TYR, TYRP1, TYRP2 and MITF in miR-186-5p transfected group, miR-186-5p+α-MSH interaction group and negative control group

2.2 miR-186-5p與α-MSH對相關蛋白表達的影響

收集各試驗組細胞并提取細胞總蛋白，通過Western blotting檢測基因表達產物的變化情況。結果顯示，與對照NC組相比，miR-186-5p轉染組和miR-186-5p+α-MSH互作組中4種蛋白質表達量都有所下降(圖2)。miR-186-5p轉染組中TYR、TYRP1、TYRP2和MITF蛋白表達分別為對照組的85%、68%、78%和62%，且差異均顯著(P<0.05)。與mRNA表達類似，miR-186-5p+α-MSH互作組中，α-MSH緩解了miR-186-5p對TYR、TYRP1、TYRP2和MITF蛋白表達的抑制作用，分別為對照組的96%(TYR)、81%(TYRP1)、85%(TYRP2)和86%(MITF)，且差異均顯著(P<0.05)。

A.TYR、TYRP1、TYRP2 和MITF蛋白免疫印跡圖；B. TYR、TYRP1、TYRP2 和MITF蛋白表達量A.Western blotting of TYR, TYRP1, TYRP2 and MITF; B. The relative protein expression of TYR, TYRP1, TYRP2 and MITF圖2 miR-186-5p轉染組、miR-186-5p+α-MSH互作組和對照組中TYR、TYRP1、TYRP2 和MITF的蛋白相對表達量Fig.2 The relative protein expression of TYR, TYRP1, TYRP2 and MITF in miR-186-5p transfected group, miR-186-5p+α-MSH interaction group and negative control group

2.3 miR-186-5p與α-MSH對綿羊黑素細胞中黑色素含量影響

為了進一步檢測 miR-186-5p與α-MSH對綿羊黑素細胞中黑色素含量的影響，運用分光光度法對各試驗組細胞進行黑色素含量測定。結果顯示，miR-186-5p能極顯著的降低綿羊黑素細胞中的黑色素含量(P<0.001)，其含量僅為對照的50.8%(圖3)。而miR-186-5p+α-MSH互作組的黑色素含量較之顯著回升。由此可見， miR-186-5p通過抑制靶基因及相關基因的表達，最終抑制了黑色素的生成。而α-MSH能緩解miR-186-5p對黑色素生成的抑制作用。

圖3 miR-186-5p轉染組、miR-186-5p+α-MSH互作組和對照組中黑色素含量Fig.3 The melanin content in miR-186-5p transfected group, miR-186-5p+α-MSH interaction group and negative control group

2.4 免疫組化檢測MITF在不同轉染組細胞中的表達差異

為了進一步了解miR-186-5p對MITF蛋白表達的影響，對不同處理組細胞中MITF蛋白進行了免疫組化定位。結果如圖4顯示，在陽性試驗組中MITF都有表達，且分布于細胞核和細胞質。與對照組相比，miR-186-5p轉染組和miR-186-5p+α-MSH互作組中MITF蛋白著色都變淺，其中miR-186-5p轉染組著色最淺，miR-186-5p+α-MSH互作組略深，對照組著色最深。該結果再次證明，在綿羊黑素細胞中miR-186-5p抑制了MITF蛋白的表達，而α-MSH能緩解miR-186-5p對MITF蛋白表達的抑制作用。

圖4 miR-186-5p轉染組、miR-186-5p+α-MSH互作組和對照組中綿羊黑素細胞MITF的免疫組化染色 (200×)Fig.4 Immunohistochemical staining of sheep melanocytes MITF protein in miR-186-5p transfected group, miR-186-5p+α-MSH interaction group and negative control group(200×)

2.5 miR-186-5p與α-MSH對黑素細胞遷移的影響

傳代培養的綿羊黑素細胞長到80%左右進行處理(轉染miR-186-5p和添加α-MSH)，同時用10 μL槍頭在培養板中間輕輕劃出痕跡。每隔一段時間進行觀察并拍照，觀察不同處理對黑素細胞遷移能力的影響。由圖5可看出，無論是對照組還是miR-186-5p轉染組或miR-186-5p+α-MSH互作組，在處理后24 h劃痕處細胞增殖、遷移均不明顯，而36 h 后劃痕處細胞生長出現差異。此時，對照組劃痕處細胞密度最大，而miR-186-5p轉染組和miR-186-5p+α-MSH互作組細胞密度相近。48 h后，對照組劃痕已完全被細胞覆蓋，而miR-186-5p轉染組和miR-186-5p+α-MSH互作組仍能看到劃痕痕跡。這些結果表明，miR-186-5p過表達能抑制綿羊黑素細胞的遷移，miR-186-5p與α-MSH協同作用時細胞的遷移能力沒有明顯變化，由此說明，α-MSH對綿羊黑素細胞的增殖、遷移影響不大。

圖5 miR-186-5p轉染組、miR-186-5p+α-MSH互作組和對照組中綿羊黑素細胞的遷移能力 (40×)Fig.5 The migration capability of melanocyts in miR-186-5p transfected group, miR-186-5p+α-MSH interaction group and negative control group (40×)

3 討 論

Tsatmali等[20]研究表明，動物外周皮膚中存在α-MSH的表達，且與皮膚色素沉著有關，α-MSH/MC1R與黑素細胞分化和黑色素的合成有關，MC1R是黑色素合成的開關基因，MC1R突變會使動物毛色性狀改變。研究表明，黑素細胞中添加α-MSH可上調TYR的表達，促進黑色素的生成[21]；Furumura等[22]發現，在人黑素細胞中，α-MSH/MC1R通過調控螺旋-環-螺旋轉錄因子調控MITF的表達，MITF通過與黑色素生成關鍵酶TYR、TYRP1和TYRP2的啟動子結合，調控TYR、TYRP1和TYRP2的表達，進而影響黑色素的生成。楊柳和呂榮鋒[23]通過免疫組織化學檢測發現，α-MSH在白色毛皮的小鼠和豚鼠中呈陰性表達，而在黑色小鼠和棕黃色豚鼠的表皮中呈陽性表達；Hunt等[24]發現，α-MSH能促進黑素細胞樹突的增加；Suzuki等[25]報道，紫外線照射能使黑素細胞停留在細胞周期的G1期, 但α-MSH能緩解紫外線的抑制作用而使細胞進入S期。Dorr等[26]報道，皮膚注射合成的強效促黑色素皮質激素[Nle4-D-Phe7]-α-MSH，能促進面部及前臂皮膚黑色素的沉著，且主要表現在真黑素合成比率增加。

Halaban[27]報道，在體外培養的細胞中，α-MSH與一些促分裂劑協同作用能促進細胞DNA的合成，但不會造成細胞數量的變化；有研究證實，α-MSH對黑色素產生的調控作用主要通過促進酪氨酸酶的合成及表達和黑素細胞有絲分裂，使其快速增殖來實現的[28]。于志慧等[19]報道，適當濃度的α-MSH添加到體外培養的羊駝黑素細胞中，不僅黑素細胞的分裂、增殖加快，而且黑素細胞的樹突變得更細、更長；但Wakamatsu等[29]報道，α-MSH對人黑素細胞沒有顯著影響；Kim等[30]研究發現，α-MSH會抑制黑色素瘤細胞中酪氨酸酶的活性，但不影響細胞的分裂增殖；Swope和Abdel-Malek[31]研究報道，α-MSH、內皮素-1(ET-1)和堿性成纖維細胞生長因子共同作用人黑素細胞，不僅抑制UVR誘導的細胞凋亡，而且刺激細胞的增殖和黑色素的生成。本研究發現，在綿羊黑素細胞中添加α-MSH對細胞的增殖、遷移沒有明顯影響，但能促進黑色素的生成，與以往報道的α-MSH能促進黑色素生成一致，但在黑素細胞中添加α-MSH是否影響細胞增殖與細胞特性、培養條件、α-MSH的添加濃度等密切相關。

以往的研究表明，miR-186與腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡有關。如miR-186通過結合不同的靶基因抑制多種癌細胞的增殖和遷移[10-12,32]；研究發現，在綿羊黑素細胞中轉染miR-186-5p能抑制黑素細胞的增殖和遷移[18]，本研究中，miR-186-5p與α-MSH共同作用時，對綿羊黑素細胞分裂增殖起抑制作用的主要是miR-186-5p。

Bemis等[33]研究發現，在黑素細胞中miR-137抑制靶基因MITF的表達，而當α-MSH與miR-137協同作用時，α-MSH能減緩miR-137對MITF表達的抑制作用，緩解因miR-137過表達引起的黑色素生成減少；MITF是miR-141-3p和miR-200a-3p的靶基因，在三維重建的人類皮膚組織中轉染miR-141-3p 和miR-200a-3p能抑制α-MSH刺激的黑色素生物合成[34]；姬凱元等[35]研究發現，在體外培養的羊駝黑素細胞中同時轉染 lpa-miR-nov-66 和添加α-MSH時， lpa-miR-nov-66能通過調控cAMP路徑抑制α-MSH對黑色素生成的正調控。

綜上，a-MSH/MC1R是黑色素生成的主要信號通路，是皮膚色素合成與沉著起始的關鍵步驟，二者的結合一方面激活和提高TYR家族的酶活性，促進黑色素的合成[5]，還能促進黑素細胞樹突的形成，加速黑素小體到角化細胞的轉運，促進黑色素的沉著[6]，另一方面通過調控螺旋-環-螺旋轉錄因子上調MITF表達，促進TYR、TYRP1和TYRP2的表達，進而影響黑色素的生成[22]，而許冬梅等[18]發現，MITF是miR-186-5p的靶基因，且miR-186-5p能通過MITF抑制黑素細胞的增殖和遷移。本研究中，在綿羊黑素細胞中轉染miR-186-5p的同時添加α-MSH，α-MSH能緩解miR-186-5p對靶基因MITF及黑色素生成關鍵基因家族TYR家族的抑制作用。

4 結 論

本研究結果顯示，在綿羊黑素細胞中miR-186-5p通過負調控MITF抑制相關基因和蛋白的表達，同時抑制黑色素的生成，而添加α-MSH激活了α-MSH/MC1R信號通路，促進相關基因和蛋白的表達以及黑色素的生物合成，因此，在綿羊黑素細胞中miR-186-5p和α-MSH協同作用時，α-MSH能減弱miR-186-5p對黑色素生成的抑制作用，由于α-MSH 對黑素細胞的增殖影響不大，因此，在細胞劃痕試驗中α-MSH并不能緩解miR-186-5p對綿羊黑素細胞遷移的抑制作用。綜上，在綿羊黑素細胞中轉染miR-186-5p的同時添加α-MSH抑制了MITF及TYR家族的表達，進而抑制了黑色素的生成和細胞的遷移。