調控牛CEBPA基因表達的miRNA篩選及對肌內前體脂肪細胞增殖和分化的影響

黃明捷，陳 祥*，張 勇*，陳 偉，

李 俊3，陸 靜1,2，張 雄4，何 琦5，吳 雨1,2

(1.貴州大學高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴陽 550025； 2.貴州大學動物科學學院，貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴陽 550025； 3.貴州省種畜禽種質測定中心，貴陽 550018；4.貴州省農業科學院畜牧獸醫研究所，貴陽 550025； 5.貴陽市花溪區農業局，貴陽 550025)

許多干細胞或細胞亞群在不同的發育階段受到大量特定基因的調控，其關鍵是轉錄因子精準調控基因表達的模式具有復雜性和特異性，而轉錄因子激活劑、阻遏物及其功能修飾劑之間相互作用的組合又進一步增加了調控網絡的復雜多樣性[1]。CCAAT/增強子結合蛋白A(CCAAT/enhancer binding protein alpha,CEBPA)，別名C/EBP、RcC/EBP-1、C/EBPα[2]，該基因基序上存在激活劑/阻遏物結合位點，能通過組織特異性和信號依賴性精準調節基因表達的轉錄因子。肌內脂肪(intramuscular fat，IMF)含量是影響肉質的重要因素，前體脂肪細胞分化則是IMF沉積不可或缺的步驟，其過程包括前體脂肪細胞指數擴增和分化兩個階段。細胞分化屬于核心階段，其過程是一系列的轉錄級聯事件[3]。在這個轉錄級聯系統中，CEBPA作為核心轉錄調控因子與脂肪細胞分化相關基因相互作用共同調節其分化。CEBPA基因在脂肪和膽固醇代謝相對較旺盛的組織中有較高的表達水平[4-6]，參與細胞的信號傳導、增殖、分化、能量代謝、應激反應和血液生成等生命活動[7]。由于CEBPA基因在生命進程中既能作為激活劑又有阻遏抑制功效，已有大量研究開始將其與人類肥胖癥、糖尿病和白血病等疾病進行聯系[8]。

成熟miRNA和相關蛋白組合形成RISC復合體(RNA-induced silencing complex，RISC)，RISC復合體與靶基因mRNA 3′UTR或5′UTR結合，以切割靶mRNA或抑制翻譯間接調節基因表達[9]，在RNA的基礎上行使自身的生物學功能，參與生命過程中一系列的重要進程，如早期發育、細胞增殖、細胞凋亡、脂肪代謝和細胞分化等生命活動[10-11]。隨著研究的不斷深入，越來越多的miRNA被發現在脂肪細胞分化過程中扮演著重要角色。miR-150能提高脂肪源性干細胞(adipose-derived stem cells，ASC)中C/EBPα的表達，促進脂肪沉積[12]；而miR-326會直接抑制C/EBPα的表達，削弱該細胞的脂肪沉積能力[13]。綿羊基質血管組分(stromal vascular fractions，SVFs)中的miR-124-3p能作為成脂過程中的調節劑，通過直接作用于C/EBPα來影響脂肪沉積[14]；miR-25通過直接結合C/EBPα抑制3T3-L1脂肪形成[15]。此外，CEBPA還能作為miRNA調節劑，通過與miRNA啟動子區特異性結合，間接調控脂肪的生成[16]。當前僅在人、綿羊脂肪干細胞以及3T3-L1細胞系發現部分miRNA能直接結合CEBPA基因調控脂肪沉積過程，在牛肌內前體脂肪細胞中是否還存在其他能直接作用于CEBPA基因的miRNA，以及這部分miRNA對牛肌內前體脂肪細胞增值和分化的影響尚未見報道。

本研究綜合運用多個生物信息學軟件篩選調控牛CEBPA基因的miRNA，結合qRT-PCR、雙熒光素酶報告系統、Western blot、CCK-8等生物學試驗探究候選miRNA對牛肌內前體脂肪細胞分化與增殖的影響,明確miRNA與CEBPA基因調控關系對肌內脂肪沉積效果的遺傳基礎，為加速關嶺牛品種改良、提高關嶺牛肌內脂肪含量、生產高檔牛肉奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 試驗動物為貴州省關嶺牛，選取飼養管理條件相同且健康的關嶺牛7頭(2歲公、母牛各3頭，1日齡犢牛1頭)，屠宰前停料、停水12 h，屠宰后迅速采集心、肝、脾、肺、腎、脂肪、腰大肌、背最長肌、股二頭肌、大腸、小腸、下丘腦、睪丸、卵巢和子宮共15個組織(用于提取RNA)，1日齡關嶺牛犢牛耳靜脈注射速眠新麻醉處死后，取背最長肌(用于提取RNA和分離培養肌內前體脂肪細胞)。用于提取RNA的樣品放入液氮罐中凍存，帶回實驗室后置于-80 ℃冰箱保存；用于分離培養肌內前體脂肪細胞的背最長肌，經75%酒精和PBS清洗后，浸泡在含1%雙抗的PBS中并置于冰盒，3 h內帶回實驗室立刻進行分離培養。

1.1.2 主要試劑 氯仿購自宏達爾生物科技有限公司；pmir GLO載體購自Promgea 公司；HEK-293T購自ATCC；pMD-19 T Vector購自寶生物工程(大連)有限公司；PBS、Ⅰ型膠原酶、DMEM/F12培養基、青鏈霉素、胰島素、地塞米松、油紅O染料、胰蛋白酶、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、BCA蛋白定量試劑盒、Opti-MEMTM培養基均購自上海索萊寶生物科技有限公司；Trizol 試劑、無水乙醇、DL2000 DNA Marker、2×Es Taq MasterMix、核酸染料、反轉錄試劑盒(HiFiScript cDNA Synthesis Kit)均購自康為世紀生物有限公司；SYBR Green qPCR Master Mix (No ROX)購自美國MCE公司；miRNA反轉錄試劑盒(miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit)和熒光定量試劑盒(miRcute Plus miRNA qPCR Kit)均購自天根生化科技(北京)有限公司；蛋白Marker、蛋白上樣緩沖液、PVDF膜均購自北京碧云天公司；山羊抗兔IgG購自中杉公司；發光試劑購自德國roche公司；GAPDH(KC-5G5)購自康成公司；CCK-8檢測試劑盒購自大連美侖生物技術有限公司；miRNA模擬物由上海吉瑪制藥技術有限公司合成；LipofectamineTM3000試劑購自Thermo Fisher。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學預測與分析 利用Starbase[17]、MiRWalk[18]、miRSystem[19]和TargetScan[20]4個在線軟件預測能直接調節CEBPA基因的miRNA。用Venny 2.1對4個軟件的預測結果做韋恩圖取交集，以聚焦調節CEBPA基因的miRNA。

1.2.2 引物設計與合成 根據GenBank公布的牛CEBPAmRNA序列(登錄號：NM_176784.2)，利用 Primer 3.0和NCBI設計CEBPA基因熒光定量引物；利用miRprimer軟件設計miRNA熒光定量引物(miRNA下游引物為試劑盒自帶的通用下游引物)；以牛GAPDH基因(登錄號：NM _001034034)作為CEBPA基因內參，參照王軍等[21]使用的U6基因作為miRNA內參，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成(表1)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.3CEBPA-3′UTR雙熒光素酶報告載體構建及雙熒光素酶活性檢測 為確定用于構建載體的序列，先以關嶺牛背最長肌cDNA為模板，通過普通PCR反應，擴增出miRNA結合區域的CEBPA-3′UTR-1片段。將擴增產物送上海生工生物工程股份有限公司測序，根據測序結果截取適當長度用于構建CEBPA-3′UTR雙熒光素酶報告載體。序列由北京擎科生物科技有限公司合成，在5′和3′分別添加SacI和XhoI酶切位點(酶切位點用下劃線斜體標注，miRNA結合位點用下劃線加粗標注)。

將合成片段與雙酶切后的Pmir-GLO載體進行連接、轉化和測序后得到野生型和突變型CEBPA-3′UTR雙熒光素酶報告質粒。將HEK-293T細胞懸液等量接種至24孔細胞培養板中，待細胞匯合度達到70%時參照Thermo Fisher LipofectamineTM3000試劑說明書進行轉染。LipofectamineTM3000 1 μL、重組質粒500 ng、miRNA mimic或miRNA NC終濃度為50 nmol·L-1。試驗分為兩組，每組設3個重復：CEBPA野生型組(共轉染Pmir-CEBPA-WT和miRNA mimic，以共轉染Pmir-CEBPA-WT和miRNA NC為對照組)、CEBPA突變型組(共轉染Pmir-CEBPA-MUT和miRNA mimic，以共轉染Pmir-CEBPA-MUT和miRNA NC為對照組)。共轉染48 h后進行雙熒光素酶活性檢測，操作步驟參照Dual-Luciferase?雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測熒光活性變化。

1.2.4 牛肌內脂肪前體細胞的分離培養、誘導分化和轉染 參照張萌萌等[22]和苑洪霞[23]的方法進行牛肌內前體脂肪細胞的分離和培養，以差速貼壁法純化肌內前體脂肪細胞。參照相奧琪[24]的方法配制誘導分化和維持分化培養基，當六孔板中F4代細胞培養完全匯合2 d后用誘導分化培養基誘導2 d (記加誘導分化培養基時為第0天)，再換成維持培養基培養至第8天。六孔板中細胞完全匯合2 d后，根據Thermo Fisher LipofectamineTM3000試劑說明書進行轉染，轉染48 h后分別提取細胞RNA和蛋白。

1.2.5CEBPA基因與miRNA熒光定量分析 利用Trizol 法提取組織、細胞總RNA，按照HiFiScript cDNA Synthesis Kit試劑盒與miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit試劑盒分別進行普通反轉錄和miRNA反轉錄。CEBPA基因與miRNA基因熒光定量反應體系和反應條件參照相應試劑盒說明書進行設置，每個樣品重復3次。

1.2.6 CEBPA蛋白表達量檢測 提取轉染miRNA模擬物48 h后的細胞蛋白，以每孔上樣量50 μg進行SDS-PAGE。將蛋白轉移至PVDF膜自然晾干后，置于95%乙醇中固定，再用0.01 mol·L-1PBST洗5 min。用5%脫脂奶粉封閉液中封閉非特異性蛋白，室溫下約4 h，再用0.01 mol·L-1PBST洗3次，每次15 min。加I抗體(1∶1 000，用0.01 mol·L-1PBST配制)，室溫下3～4 h，再用0.01 mol·L-1PBST洗3次，每次15 min。加HRP標記的二抗(1∶1 000，用0.01 mol·L-1PBST配制)，室溫下1～2 h，再用0.01 mol·L-1PBST洗3次，每次15 min。將PVDF置于化學發光試劑中增強反應1～3 min，Blo-RAO掃描拍照。

1.2.7 CCK-8檢測 將細胞懸液等量接種到96孔板中(每孔100 μL)，并置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。24 h后分別轉染miRNA mimic和miRNA NC，每組設置5個重復。在待測孔中加入10 μL CCK-8試劑后孵育2 h，再用酶標儀檢測450 nm 處吸光度。

2 結 果

2.1 調控CEBPA基因的miRNA預測

通過聚焦4個在線軟件的預測結果(圖1A)，發現miR-23、miR-181、miR-101、miR-144、miR-186和miR-326與CEBPA基因3′UTR存在潛在作用關系。C/EBPβ(CEBPB)、C/EBPδ(CEBPD)和PPARγ(PPARG)對前體脂肪細胞分化過程均發揮一定作用[25-28]，為提高篩選精度，排除這些基因中可能存在調控關系的miRNA，故選擇miR-23和miR-181進行下一步試驗。bta-miR-23和bta-miR-181家族中的miRNA種子序列里均有相似堿基能與CEBPA3′UTR相結合(圖1B)，最終以bta-miR-23a、bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a、bta-miR-181b、bta-miR-181c、bta-miR-181d作為候選miRNA。

A. miRNA聚焦預測結果；B. 候選miRNA與CEBPA基因3′UTR結合位點A.miRNA focus prediction results; B. The binding site of candidate miRNA and CEBPA gene 3′UTR圖1 與CEBPA存在潛在調控關系的miRNA預測結果Fig.1 Prediction results of miRNA with potential regulatory relationship with CEBPA

2.2 CEBPA mRNA在各組織中的差異表達

通過qRT-PCR發現(圖2)，CEBPAmRNA在肌肉組織(背最長肌、股二頭肌、腰大肌)、睪丸、卵巢中的相對表達量極顯著低于心、肝、脾、肺、脂肪等組織(P<0.01)；CEBPA基因在心中的表達量最高，極顯著高于除下丘腦外的其他組織(P<0.01)；CEBPA基因在下丘腦呈高表達，極顯著高于除心、肺、脂肪以外的組織(P<0.01)；同時，還發現CEBPA基因在2周歲關嶺牛背最長肌的表達量極顯著高于1日齡犢牛(P<0.01)；CEBPA基因在睪丸中表達量極顯著高于卵巢(P<0.01)，且在母牛不同生殖器官中的表達量存在極顯著差異，在子宮中表達量極顯著高于卵巢(P<0.01)。

上標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，上標不同大寫字母或**表示差異極顯著(P<0.01)，上標不同小寫字母或*表示差異顯著(P<0.05)，下同The same letter on the top indicates that the difference is not significant (P>0.05), the superscript different capital letters or ** means the difference is extremely significant (P<0.01), and the superscript different lowercase letters or * means the difference is significant(P< 0.05), the same as below圖2 CEBPA mRNA在關嶺牛不同組織中的表達差異性Fig.2 Expression differences of CEBPA Gene in different tissues of Guanling cattles

2.3 候選miRNA與CEBPA的調控關系

當前，大量探究miRNA與目標基因3′UTR作用關系的試驗采用的均是雙熒光素酶報告系統[29-30]。雙熒光素酶報告系統檢測結果如圖3所示，miR-23a+CEBPA-3′UTR-WT組熒光活性極顯著低于miR-NC+CEBPA-3′UTR-WT組(P<0.01)，且顯著低于miR-23a+CEBPA-3′UTR-MUT組(P<0.05)，說明bta-miR-23a與CEBPA基因mRNA的3′UTR具有直接調控關系；miR-23b-3p+CEBPA-3′UTR-WT組、miR-181a+CEBPA-3′UTR-WT組轉染后熒光活性均極顯著低于miR-NC+CEBPA-3′UTR-WT組和miR-mimic+CEBPA-3′UTR-MUT組(P<0.01)，表明miR-23b-3p、miR-181a均能抑制CEBPA基因mRNA 3′UTR活性。

圖3 雙熒光素酶檢測結果Fig.3 Dual luciferase test results

2.4 CEBPA基因和miRNA在牛肌內前體脂肪細胞分化過程中的表達趨勢分析

利用“雞尾酒法”誘導細胞分化，檢測誘導0、2、6、8 d時CEBPAmRNA、bta-miR-23a、bta-miR-23b-3p和bta-miR-181a表達量，其結果見圖4。CEBPA基因在分化初期呈低表達，隨著分化時間逐漸升高，第8天的表達量極顯著高于第0、2、6天(P<0.01)，而bta-miR-23a、bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a在細胞分化初期呈現高表達，極顯著高于其他時期(P<0.01)。在表達量變化趨勢上，bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a的在細胞不同分化時期的表達量與CEBPA基因的表達趨勢相反；bta-miR-23a除在分化初期高表達外，第2、6、8天處于較低表達水平，且這3個時間段間的表達水平差異不顯著(P>0.05)。

圖4 CEBPA、miR-23b-3p、miR-23a和miR-181a在牛肌內前體脂肪細胞不同分化時期的表達量變化Fig.4 Changes in the expression levels of CEBPA, miR-23b-3p, miR-23a and miR-181a in cattle intramuscular precursor adipocytes at different stages of differentiation

2.5 過表達miRNA對CEBPA mRNA和蛋白表達以及細胞分化的影響

過表達miRNA 48 h后，miRNA、CEBPAmRNA 與蛋白變化情況分別見圖5、6。由圖5B可知，3個miRNA mimic均能極顯著降低CEBPAmRNA表達量(P<0.01)，其中，miR-23b-3p比miR-23a、miR-181a降低CEBPA表達效果更強，但未達顯著水平(P>0.05)。由圖6B可知，過表達miR-23a、miR-23b-3p、miR-181a均能極顯著降低CEBPA蛋白表達(P<0.01)，在過表達后對CEBPA蛋白抑制效果最強的是miR-23b-3p組，表明miR-23a、 miR-23b-3p、miR-181a均能抑制牛肌內前體脂肪細胞中CEBPA基因的表達。由圖7可觀察到，分別過表達miR-23a、miR-23b-3p、miR-181a后牛肌內前體脂肪細胞中脂滴數均少于miR-NC組，表明miR-23a、miR-23b-3p、miR-181a均能降低牛肌內前體脂肪細胞中脂滴含量。由此可知，miR-23a、miR-23b-3p、miR-181a均能通過抑制CEBPA基因的表達來調節牛肌內前體脂肪細胞分化。

A. 過表達miRNA后熒光定量PCR檢測miRNA變化；B. 過表達miRNA后熒光定量PCR檢測CEBPA表達量A. Fluorescence quantitative PCR to detect changes in miRNA after overexpression of miRNA; B.Detection of CEBPA expression by fluorescence quantitative PCR after overexpression of miRNA圖5 過表達miRNA后牛肌內前體脂肪細胞miRNA和CEBPA mRNA表達量變化Fig.5 Changes of miRNA and CEBPA mRNA expression in cattle intramuscular precursor adipocytes after overexpression of miRNA

A. 過表達miR-23a、miR-23b-3p、miR-181a后CEBPA的Western blot條帶；B.過表達miR-23a、miR-23b-3p、miR-181a后CEBPA蛋白的相對表達量A. Western blot band of CEBPA after overexpression of miR-23a, miR-23b-3p, miR-181a; B. Relative expression of CEBPA protein after overexpression of miR-23a, miR-23b-3p and miR-181a圖6 過表達miR-23a、miR-23b-3p、miR-181a后CEBPA蛋白相對表達量變化Fig.6 Changes in relative expression of CEBPA protein after overexpression of miR-23a, miR-23b-3p and miR-181a

A～D.分別過表達miR-NC、miR-23a、miR-23b-3p、miR-181a后油紅O染色圖A-D. Oil red O staining diagram after overexpression of miR-NC, miR-23a, miR-23b-3p, miR-181a圖7 在牛肌內前體脂肪細胞中過表達miR-23a、miR-23b-3p、miR-181a后誘導分化8 d時油紅O染色結果(200×)Fig.7 Oil red O staining results after 8 days of overexpression of miR-23a, miR-23b-3p and miR-181a in cattle intramuscular precursor adipocytes (200×)

2.6 過表達miRNA對牛肌內前體脂肪細胞增殖的影響

運用CCK-8檢測過表達miRNA后對細胞增的影響，試驗結果如圖8所示，轉染24 h后，3個處理組細胞增殖效果較miRNA NC組無顯著變化(P>0.05)；轉染48 h后，3個處理組細胞增殖效果較轉染miRNA NC組呈極顯著增強(P<0.01)，而轉染miR-23a mimic、miR-23b-3p mimic對細胞增殖效果顯著高于miR-181a mimic(P<0.05)；轉染72 h 后，3個處理組對細胞增殖影響差異不顯著(P>0.05)。 CCK-8檢測結果表明，bta-miR-23a、bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a僅在關嶺牛肌內前體脂肪細胞增殖過程中階段性的發揮促進作用。

圖8 過表達miRNA對牛肌內前體脂肪細胞增殖的影響Fig.8 Effect of overexpression of miRNA on the proliferation of cattle intramuscular precursor adipocytes

3 討 論

CEBPA基因作為重要的轉錄調節因子，廣泛存在于機體各類組織中[31]。Williams等[32]研究表明，CEBPA基因在肝和脂肪組織中有較高表達水平，本研究也發現CEBPA基因在關嶺牛心、肝、脾、肺、脂肪中的表達水平極顯著高于肌肉(背最長肌、股二頭肌、腰大肌)組織(P<0.01)。此外，下丘腦是調控食欲和維持能量代謝穩態的關鍵區域[33]，本研究在下丘腦中檢測到CEBPA基因呈高表達，這與該基因的信號傳導功能有關[34]。CEBPA基因參與卵巢促性腺激素生成以及睪丸的損傷修復[35-36]，本試驗在關嶺牛卵巢、子宮和睪丸中均檢測到CEBPA基因有不同程度的表達。這表明，CEBPA基因是機體正常生殖活動不可或缺的因子。

動物基因3′UTR包含多個miRNA特定結合區域[37]，多個miRNA協同作用于靶基因，通過調節基因表達影響基因功能，進而調控信號傳導、增殖分化、IMF沉積等過程。已有大量研究采用“生物信息學+生物試驗學”方法驗證miRNA與其靶基因的調控關系[38-40]。本研究利用多個在線軟件篩選出6個與牛CEBPA基因具有潛在調控關系的miRNA，并通過雙熒光素酶活性檢測證實bta-miR-23a、bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a能直接作用于CEBPAmRNA的3′UTR。Bi等[41]已證實巨噬細胞中的miR-181a能直接調節C/EBPα基因。

CEBPα表達水平與細胞分化時間呈線性增長關系[3]，本研究發現CEBPA基因在分化初期呈低表達，隨著分化時間逐漸升高，這與牟彥雙等[42]和張萌萌等[22]的研究結果一致。此外，CEBPα在分化初期表達水平較低，而bta-miR-23a、bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a在分化初期呈現高表達且極顯著高于其他時期(P<0.01)，整個分化時期bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a與CEBPA基因的表達趨勢相反。Shen等[43]指出，miR-23a在3T3-L1細胞分化0 d時呈高表達狀態，而在分化期間miR-23a的表達降低了4倍以上。過表達miR-23a、miR-23b-3p、miR-181a后，均能極顯著降低CEBPA基因mRNA和蛋白表達量(P<0.01)，3個miRNA僅在細胞增殖過程中發揮階段性促進作用。miR-23a在脂肪細胞分化過程中起抑制作用[43-44]，miR-23b-3p、miR-181a通過直接作用于關鍵轉錄因子調控多種細胞周期和分化[45-48]。

miRNA、轉錄因子以及調控轉錄因子的miRNA共同參與對CEBPA表達調控過程。一些miRNA能直接作用于CEBPA影響其表達，如miR-181a、miR-124-3p、miR-326、miR-182、miR-25是CEBPA基因的直接調控miRNA[41,49-51]；另一些miRNA則通過結合對CEBPA表達有影響的轉錄因子，間接介導對CEBPA的調控，如miR-342-3p、miR-204-5p、miRNA-7b-5負調控轉錄因子來影響CEBPA表達[52-54]。在脂肪細胞分化過程中，CEBPA與PPARγ相互促進，形成一個正反饋環[55]。因此，miRNA對PPARγ的調節效果會間接影響CEBPA表達。已有研究表明，miR-454、miR-130a/b、miR-425-5p、miR-27b能直接或間接抑制PPARγ[56-59]。此外，CEBPA基因也能通過與miRNA基因啟動區結合，進而積極調節miRNA的表達[16,60]。本研究確認了miR-23a、miR-23b-3p、miR-181a能負調控CEBPA基因，基于已有的報道和本研究結果，構建出miRNA與CEBPA之間通路如圖9所示。

⊕表示正調控；?表示負調控⊕means positive regulation；?means negative regulation圖9 miRNA直接或間接調控CEBPA的通路圖Fig.9 Pathways of miRNA regulating CEBPA directly or indirectly

4 結 論

CEBPAmRNA在關嶺牛內臟組織、肌肉組織、脂肪、下丘腦以及部分生殖器官中均有表達。生物信息學篩選和生物學試驗結果表明，bta-miR-23a、bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a能階段性的促進牛肌內前體脂肪細胞增殖，并負調控CEBPA基因抑制牛肌內前體脂肪細胞分化。