基于H蛋白表位合成肽的小反芻獸疫病毒抗體間接ELISA檢測方法的建立

錢 榜，李彥敏,2，朱學亮，張學燕，Niyokwishimira Alfred，竇永喜*，張志東,2

(1.中國農業科學院蘭州獸醫研究所，家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，蘭州 730046；2.西南民族大學畜牧獸醫學院，成都 610041)

小反芻獸疫(peste des petits ruminants，PPR)是由副黏病毒科麻疹病毒屬小反芻獸疫病毒(peste des petits ruminants virus, PPRV)所引起的一種對小反芻類動物具有高度致死性的病毒病[1-2]，主要通過直接接觸經呼吸系統傳播，亦可通過精液、胚胎和乳汁等途徑傳播，是一種高度接觸性傳染病。PPRV主要宿主為山羊和綿羊等小反芻類動物，報道表明駱駝[3-4]、牛和水牛等大型反芻動物也可被感染[5-6]，但通常為亞臨床癥狀。此外，獅子、犬[7]、瞪羚、大羚羊、藍羚羊[8]以及野豬[9]也可感染PPRV。PPRV感染后臨床癥狀主要表現為發熱、肺炎、腹瀉，呼吸道和消化道黏膜炎癥等[10]。PPR被世界動物衛生組織(OIE)列為法定報告的動物疫病，我國將其列為一類動物疫病[2,11-12]。自2007年在我國首次報道以來，該病在我國西藏、山東、內蒙古等省(區)蔓延傳播[13-15]，對我國畜牧業的健康、有序發展造成嚴重挑戰[16]。

PPRV只有1個血清型，根據 F蛋白及N蛋白基因序列將PPRV分為4個譜系(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)[17-19]，其中，我國流行的主要為Ⅳ系。該病毒為單股負鏈RNA病毒，共編碼8個蛋白，分別為融合蛋白(F)、血凝集素蛋白(H)、基質蛋白(M)、核衣殼蛋白(N)、磷蛋白(P)和大蛋白(L)6個結構蛋白以及2個非結構蛋白(C、V)[20-21]。N蛋白是病毒中含量最為豐富且免疫原性最強的蛋白，基于N蛋白的PPRV診斷技術已被廣泛開發應用。H蛋白為病毒囊膜蛋白，分為膜內區和膜外區，是麻疹病毒屬保守性最差的蛋白之一，該蛋白通過與宿主細胞受體結合從而決定病毒的細胞嗜性[22]，其為誘導宿主保護性免疫反應的主要蛋白[23-24]。目前，針對PPRV的血清學檢測大部分以N和H蛋白產生的抗體為基礎。由于N蛋白不能誘導機體產生針對病毒的免疫保護且在麻疹病毒屬病毒中具有高度保守性，以N蛋白為基礎建立的檢測方法會產生一定的交叉反應[25]；H蛋白在麻疹病毒屬所有成員中最為多樣化，種屬特異性強，且可誘導保護性免疫反應，因此該蛋白在DIVA(區分疫苗免疫和自然感染動物)和免疫保護率檢測上具有一定的優勢。

準確地對PPR進行診斷和疫苗免疫效果檢測有利于該病的預防控制，因此，本研究在PPRV H蛋白B細胞抗原表位篩選鑒定的基礎上，選擇與PPRV特異性抗體具有較好反應原性的B細胞抗原表位片段，然后將其串聯后進行合成，以合成的多肽作為包被抗原，建立PPRV H蛋白抗體iELISA檢測方法，對現有PPR檢測方法進行補充，為該病的控制和消除提供技術手段。

1 材料與方法

1.1 病毒株、血清及主要試劑

PPRV Nigeria 75/1疫苗毒株、PPRV標準陰性和陽性血清、O型口蹄疫病毒(FMDV)標準陽性血清、羊痘病毒(GPV)陽性血清、羊臨床血清樣品由中國農業科學院蘭州獸醫研究所家畜疫病病原生物學國家重點實驗室制備保存；藍舌病病毒(BTV)陽性血清由中國農業科學院蘭州獸醫研究所獨軍政博士惠贈。PPRV cELISA檢測試劑盒購自法國ID-Vet公司；辣根過氧化物酶標記的兔抗羊IgG二抗購自SIGMA公司；TMB底物溶液購自Sumodics公司；BSA購自ExCell Bio公司；Silk-milk購自BD公司，酪蛋白(Casin)購自SIGMA公司。

1.2 H蛋白B細胞抗原表位多肽的設計合成

本實驗室用IEDB、Immunomedicine Group以及BepiPred 3種生物信息學軟件對H蛋白的B細胞抗原表位進行預測，共得到27條抗原表位肽并合成這些多肽，然后通過iELISA方法篩選鑒定，鑒定出了8個H蛋白具有反應原性的B細胞表位，具體見表1[26]。然后，選擇其中反應原性最好的4個表位H123、H185、H362、H487，以GS作為接頭進行串聯，送上海強耀生物有限公司合成該肽段。

表1 PPRV H蛋白具反應原性的B細胞表位Table 1 B cell epitopes with reactionogenicity

1.3 PPRV H蛋白抗體檢測iELISA方法的建立

1.3.1 iELISA方法 將合成的表位肽用包被液稀釋后包被96孔酶標板，放于4 ℃過夜孵育；取出PBST洗板3～5次后甩干，加入含2%BSA的PBST于37 ℃封閉1 h；洗板后加入經稀釋后的血清，置于37 ℃溫箱中孵育1 h；PBST洗板3～5次后甩干，加入經稀釋后的酶標二抗，置于37 ℃溫箱中孵育1 h；PBST洗板3～5次后甩干，加入底物TMB，每孔100 μL， 置于37 ℃溫箱中孵育15 min；取出酶標板，每孔加入100 μL 2 mol·L-1H2SO4終止反應；酶標儀讀取OD450 nm值。每個做2個重復孔。

1.3.2 表位肽抗原最適包被量和血清稀釋度的優化 將表位肽抗原按照3×10-5、2.5×10-5、2.0×10-5、1.5×10-5、1.0×10-5、0.5×10-5μg·mL-1的濃度以pH9.6的碳酸氫鹽緩沖溶液為包被液包被96孔酶標板，每孔100 μL, 4 ℃過夜孵育。PPRV標準陰、陽性血清分別用PBST按照1∶25、1∶50、1∶100、1∶200稀釋，每孔100 μL，酶標二抗用PBST按照說明書推薦稀釋度1∶40 000稀釋，底物為100 μL TMB溶液，終止液為100 μL 2 mol·L-1的H2SO4溶液，按照iELISA操作方法進行試驗，讀取OD450 nm值，選取P/N值較大的組合對應的抗原包被量及血清稀釋度作為最佳抗原包被量和最佳血清稀釋度。

1.3.3 酶標二抗稀釋度及其稀釋液的篩選和確定 在確定表位肽包被量及血清稀釋度的基礎上，保持底物及終止液不變，將酶標二抗按1∶40 000及1∶80 000進行稀釋，稀釋液分別用5% Silk-Milk-PBS、0.5%BSA-PBS、PBST進行稀釋，按照iELISA操作方法進行試驗，讀取OD450 nm值，選擇P/N值最大的數值對應的酶標二抗稀釋度和稀釋液種類作為最適稀釋度及其稀釋液。

1.3.4 包被液的篩選 在確定表位肽包被量、血清稀釋度、酶標二抗稀釋度及其稀釋液的基礎上，以pH7.3的PBS溶液、pH7.6的碳酸鹽緩沖液以及pH9.6的碳酸氫鹽緩沖液分別作為包被液包被表位肽抗原，保持其他條件不變，按照iELISA操作方法進行試驗，讀取OD450 nm值，選取P/N值最大的數值對應的包被液作為最佳包被液。

1.3.5 封閉液的篩選 在確定表位肽包被量、包被液、血清稀釋度、酶標二抗稀釋度及其稀釋液的基礎上，保持其他條件不變，以10%的酪蛋白(Casin)-PBS、5%Silk-Milk-PBS、2%BSA-PBS分別作為封閉液，其他條件不變，按照iELISA操作方法進行試驗，讀取OD450 nm值，選取P/N值最大的數值對應的封閉液作為最佳封閉液。

1.3.6 血清稀釋液的篩選 在確定表位肽包被量、包被液、封閉液、血清稀釋度、酶標二抗稀釋度及其稀釋液的基礎上，以5%Milk-PBS、2%BSA-PBS及PBST作為血清稀釋液，保持其他條件不變，按照iELISA操作方法進行試驗，讀取OD450 nm值，選取P/N值最大的數值對應的血清稀釋液作為最佳血清稀釋液。

1.4 重復性及特異性的測定

1.4.2 特異性試驗 按照優化的iELISA操作方法，分別對PPRV標準陰、陽性血清、O型口蹄疫病毒標準陽性血清、羊痘病毒陽性血清及藍舌病病毒陽性血清樣品各3份進行檢測，以此判斷此方法的特異性。

1.5 靈敏度分析

用該方法對稀釋后的血清進行檢測，根據檢測結果判定陽性血清最大稀釋倍數，從而評價所建立的iELISA檢測方法的靈敏度。

1.6 臨床血清樣本符合率檢測

分別用建立的iELISA方法和ID-Vet公司PPRV cELISA檢測試劑盒同時檢測臨床采集的306份羊血清樣本，統計計算兩種方法檢測結果的符合率。

2 結 果

2.1 多表位肽抗原串聯及合成

表位肽串聯結果如表2所示，串聯后送上海強耀生物有限公司進行合成，總量10 mg。合成肽產物經HPLC及MS分析，結果如圖1A、B所示，顯示串聯后的表位肽成功合成，純度為90.57%。

A. HPLC分析；B. MS分析A. HPLC analysis; B. MS analysis圖1 合成多肽的HPLC、MS分析結果Fig.1 A HPLC and MS analysis report of synthetic multi-peptide

表2 H蛋白部分B細胞表位串聯的表位肽序列Table 2 A part of Series connection B cell epitopes sequence of H protein

2.2 表位肽抗原最適包被量及血清稀釋度的優化

以不同量表位肽抗原包被96孔酶標板，陰、陽性血清做1∶25、1∶50、1∶100、1∶200稀釋，按iELISA操作方法進行多次方陣滴定試驗，結果如圖2，通過比較可知在表位肽包被量為1.5×10-6μg·孔-1、血清1∶100稀釋時P/N值最高，因此確定1.5×10-6μg·孔-1為表位肽抗原最適包被量，1∶100為血清最佳工作濃度。

圖2 最適抗原包被量和血清最佳稀釋度的確定Fig.2 Determination of optimal amount of antigen coating and kind of serum dilution

2.3 酶標二抗稀釋度及稀釋液的篩選和確定

固定包被抗原量和血清稀釋度，辣根過氧化物酶標記的兔抗羊IgG二抗篩選結果如圖3A所示，表明1∶80 000為該酶標二抗的最佳稀釋度；對酶標二抗稀釋液篩選結果如圖3B，則PBST為最佳酶標二抗稀釋液。

A. 稀釋濃度的確定；B. 稀釋液的篩選A. Determination of antibody concentration; B. Determination of antibody diluent圖3 酶標二抗稀釋濃度、稀釋液的篩選Fig.3 Determination of antibody concentration and antibody diluent of enzyme labeled secondary antibody

2.4 包被液、封閉液、血清稀釋液的篩選

對3種包被液、3種封閉液和3種血清稀釋液的篩選結果分別見圖4～6，通過篩選可知：碳酸氫鹽緩沖液為此方法最適包被液，2%BSA-PBS為最適封閉液，PBST溶液為最適血清稀釋液。

圖4 包被液的篩選Fig.4 Determination of coated buffer

圖5 封閉液的篩選Fig.5 Determination of blocking buffer

圖6 血清稀釋液的篩選Fig.6 Determination of serum dilution buffer

2.5 判定標準的確定

表3 237份PPRV陰性血清樣本檢測OD450 nm值統計結果Table 3 Detection results of 237 serum samples of PPRV negative

2.6 重復性分析結果

批內重復性試驗如表4所示，結果顯示所檢測的4份血清同批次不同酶標板之間變異系數最大的為8.3%，最小的為3.47%，均小于10%，說明該方法具有良好的批內重復性；不同批次間重復性結果如表5所示，不同批次包被抗原檢測的4份血清各批次之間的變異系數均小于10%，說明該方法不同批次之間具有良好的重復性。

表4 批內重復性檢測結果Table 4 Results of batch repeatability detection

表5 批間重復性檢測結果Table 5 Results of different batch repeatability detection

2.7 特異性分析

通過對PPRV標準陰性和陽性血清、O型口蹄疫病毒標準陽性血清、羊痘病毒陽性血清以及藍舌病病毒陽性血清各3份進行檢測，各種血清的OD450 nm平均值結果如圖7所示，除3份PPRV陽性血清平均值為陽性外，其他血清平均值均為陰性，說明建立的iELISA檢測方法與O型口蹄疫病毒、羊痘病毒和藍舌病病毒的陽性血清均無交叉反應，具有良好的特異性。

圖7 特異性檢測Fig.7 The results of specificity detection

2.8 靈敏度分析

用建立的iELISA檢測方法對稀釋后的PPRV陽性血清進行檢測，結果顯示，當陽性血清稀度為1∶200 時，OD450 nm值仍大于臨界值0.25(圖8)，說明建立的iELISA檢測方法具有較好的靈敏度。

圖8 靈敏度檢測Fig.8 Sensitivity detection

2.9 臨床血清樣本符合率檢測

本研究建立的iELISA方法與ID-Vet公司的商品化PPRV cELISA檢測試劑盒平行檢測306份臨床羊血清，檢測結果統計如表6所示，cELISA檢測陽性血清為69份，陰性血清237份；iELISA檢測陽性51份，可疑17份，陰性238份，兩者相對符合率為92.81%。

表6 相對符合率統計Table 6 Statistics of relative coincidence rate

3 討 論

小反芻獸疫為一種急性、烈性的國家一類動物傳染病，目前，尚無有效的治療方法[27]，這為該病的有效防控增加了難度，因此，建立快速準確的檢測方法對該病的防控尤為重要。ELISA因其快速、靈敏等特點而被廣泛應用于PPRV抗原和抗體的檢測。

多抗原表位進行串聯合成時在連接處插入柔性氨基酸進行連接，有利于促進蛋白酶水解的效率，提高抗原表位的遞呈效率。在兩個抗原表位之間以“GPGPG”作為連接位點可以避免形成新的表位片段[28]；然而在抗原表位之間以“AAY”作為連接點則可在一定程度上提高抗原表位的切割效率[29]。甘氨酸和絲氨酸是所有氨基酸中最具柔性的氨基酸，在各個抗原表位之間插入柔性氨基酸進行連接，不僅能夠避免在連接處形成新的抗原表位序列，而且能夠保證不同抗原表位充分暴露。本研究采用甘氨酸(G)和絲氨酸(S)作為多表位抗原片段之間串聯的連接位點，因此在各個B細胞抗原表位連接處加入了GS序列進行間隔。

以PPRV H蛋白中和單克隆抗體為基礎的cELISA和阻斷ELISA的檢測方法也已經建立[31-32]，且利用病毒H蛋白單克隆抗體建立的ELISA檢測方法能夠有效提高試驗結果的準確性。研究顯示，利用原核表達系統表達的PPRV H蛋白，作為抗原建立的iELISA檢測方法與ID-Vet公司的商品化PPRV cELISA試劑盒相比符合率達到93.75%[33]。PPRV N蛋白454—472位氨基酸序列具有針對PPRV非常強的免疫原性，452—472氨基酸區域為其線性B細胞表位，PPRV能夠被該區域產生的多肽抗體特異性識別，利用這一優勢建立的檢測方法可用于PPRV與RPV的鑒別診斷；以N蛋白為抗原建立的ELISA檢測方法需依賴該蛋白特定抗原表位產生的單克隆抗體與被檢樣品中相應抗體之間的相互競爭，由于與N蛋白交叉反應的缺乏，在陰性對照中只能觀察到45%的競爭率[34]。麻疹病毒H蛋白是細胞嗜性的主要決定因素，牛瘟病毒H蛋白是導致兔化弱毒株跨種致病的主要原因[35]，這些研究表明H蛋白為麻疹病毒屬病毒最重要的毒力蛋白。已有相應研究對PPRV H蛋白的功能域進行繪制，位于263—368位以及539—609位氨基酸位點的免疫顯性表位最多[36-37]，由于H蛋白在麻疹病毒屬成員中是最為多樣化的，所以以H蛋白作為靶標進行設計DIVA檢測方法具有相當的優勢。

本研究以篩選的PPRV H蛋白B細胞抗原表位為基礎，將鑒定后反應原性較好的4段抗原表位串聯后合成作為包被抗原建立針對H蛋白抗體的iELISA檢測方法，通過對306份臨床血清檢測證實其與ID-Vet公司的商品化PPRV cELISA檢測試劑盒相比符合率為92.81%，與羊痘、口蹄疫、藍舌病病毒陽性血清無交叉反應，說明建立的檢測方法具有較好的敏感性和特異性，可用于臨床血清檢測，具有開發相關檢測試劑盒的可能性。

4 結 論

建立了針對PPRV H 蛋白抗體的iELISA檢測方法,該方法特異敏感，與ID-Vet公司的商品化PPRV cELISA檢測試劑盒相比符合率為92.81%，可用于臨床血清樣品檢測。