人肺腺癌PD-L1的表達及與CD8+T淋巴細胞的相關性*

王婧華,楊寶軍,張芳

平煤神馬醫(yī)療集團總醫(yī)院病理科(河南平頂山 467000)

肺癌屬于一種起源于肺部支氣管黏膜或者腺體的惡性腫瘤，患者多伴隨著胸痛、喘鳴、咳嗽、咳血等臨床癥狀[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)[2]，我國肺癌的發(fā)病率和病死率均較高，其中肺腺癌為肺癌的重要組成部分，其發(fā)病率呈現(xiàn)為逐步上升的趨勢。但目前臨床上對于肺腺癌的發(fā)生機制尚不完全明確，多采用手術(shù)、放化療等手段進行治療，但部分患者預后不良，5年生存率較低，因此尋找早期診斷肺腺癌的敏感指標對改善患者預后具有重要的意義。腫瘤細胞免疫逃逸是目前臨床所研究的熱點，其中程序性死亡因子配體1(PD-L1)與腫瘤免疫逃逸相關[3]。CD8+T屬于T淋巴細胞亞群，參與機體免疫調(diào)節(jié)[4]。在本研究中，探討人肺腺癌PD-L1與腫瘤中CD8+T淋巴細胞的相關性，為臨床上肺腺癌的早期診治提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2018年1月至2019年12月收治的肺腺癌患者80例，男45例，女35例，年齡46～70歲，平均(56.2±10.2)歲，41例有吸煙史，分化程度：低分化29例，中/高分化51例，28例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期37例，Ⅲ+Ⅳ期43例。本研究患者及其家屬均知情，簽署知情通知書，并經(jīng)過我院倫理委員會批準。納入標準：經(jīng)病理組織學診斷為肺腺癌，均未接受過放療、化療、免疫治療。排除標準：合并其他腫瘤的患者；合并全身感染性疾病的患者；心、腎功能不全的患者；病歷資料不全患者。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 取所有肺腺癌患者手術(shù)切除癌組織及癌旁組織標本，其中1/2組織標本采用40 g/L的多聚甲醛進行固定，并進行常規(guī)石蠟包埋，厚度為3 μm，連續(xù)切片作免疫組化標記。另外1/2標本使用機械分離加酶消化聯(lián)合梯度離心法制備癌組織、癌旁組織單個核細胞懸液，待用。

1.2.2 PD-L1免疫組化檢測 將石蠟切片在二甲苯中重復脫蠟處理10 min，行梯度酒精水化，將蛋白酶修復液加入在溫度為37℃的恒溫冰箱中行孵化處理，孵化處理30 min，去除抗原修復液，將所制備的切片轉(zhuǎn)移至內(nèi)含3% H2O2的濕盒中，密封(去過氧化物酶封閉液)，在溫度為37℃的恒溫冰箱中行孵化處理，孵化處理10 min，使用PBS清洗。清洗完成后將山羊血清加入，在室溫下封閉處理，處理30 min，將封閉液吸處除(濾紙)，加入一抗，放入至適合后加入二抗，在室溫下孵育處理，處理1 h，運用PBS清洗，行DAB顯色處理10 min，采用梯度乙醇進行脫水，采用二甲苯?jīng)_洗片3次一直到透明，采用中性樹脂封片處理，顯微鏡下觀察免疫組化染色情況。每份標本在鏡頭下隨機選擇5個視野，所有病理切片均由2位以上經(jīng)驗豐富的醫(yī)師采用雙盲法進行確診。

1.2.3 PD-L1蛋白表達量檢測 采用Western blot法檢測PD-L1表達。提取單個核細胞蛋白，BCA法定量分析，50 μg蛋白樣品上樣后做SDS-PAGE電泳處理，之后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，避光封閉1 h洗滌，將1∶1 000比例稀釋的PD-L1一抗稀釋溶液，4℃下過夜，洗滌，將1∶5 000比例稀釋的PD-L1二抗稀釋溶液加入，溫床孵育1 h后洗滌，發(fā)光液ECL加入，曝光3次，取重疊值。分析蛋白條帶灰度值。

1.2.4 CD8+T淋巴細胞含量檢測 采用四色熒光流式細胞儀檢測人肺腺癌組織和癌旁組織中CD8+T淋巴細胞含量，使用FCS Express V3流失分析軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 PD-L1、CD8+T淋巴細胞在人肺腺癌組織和癌旁組織中的表達比較 肺腺癌組織中PD-L1蛋白表達量、CD8+T淋巴細胞含量高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1和圖1。

表1 PD-L1、CD8+T淋巴細胞在人肺腺癌組織和癌旁組織中的表達比較

注：A:癌旁組織；B:肺腺癌組織

2.2 PD-L1、CD8+T淋巴細胞與肺腺癌病理特征的關系 PD-L1蛋白表達量、CD8+T淋巴細胞含量在不同性別、年齡、吸煙史上對比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。PD-L1蛋白表達量、CD8+T淋巴細胞含量在不同分化程度、TNM、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期上對比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅲ+Ⅳ期肺腺癌組織中PD-L1蛋白表達量、CD8+T淋巴細胞含量高于中/高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅰ+Ⅱ，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。PD-L1、CD8+T淋巴細胞肺腺癌分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關。見表2。

表2 PD-L1、CD8+T淋巴細胞與肺腺癌病理特征的關系

2.3 PD-L1、CD8+T淋巴細胞之間相關性分析 PD-L1、CD8+T淋巴細胞之間Pearson相關性分析，結(jié)果顯示，PD-L1與CD8+T淋巴細胞水平呈正相關(r=0.344，P=0.002)。見圖2。

圖2 PD-L1、CD8+T淋巴細胞之間相關性

3 討論

近年來，隨著環(huán)境污染日益嚴重、吸煙人群的不斷增加，我國肺癌的發(fā)病率、病死率呈現(xiàn)為逐年升高趨勢，其中以肺腺癌類型為主[5]。在本研究中探討人肺腺癌PD-L1與腫瘤中CD8+T淋巴細胞的相關性，為臨床上肺腺癌的早期診治提供參考。

程序性死亡因子1(PD-1)屬于一種免疫細胞共抑制分子，為免疫球蛋白超家族成員，分子量為50～55 kD，在多種細胞表面上表達，包括NK細胞、活化B細胞、單核細胞、活化CD8+T細胞、活化CD4+T細胞、樹突狀細胞等，與自身免疫耐受性顯著相關[6-7]。PD-L1為PD-1配體，屬于一種負性共刺激分子，PD-L1位于9p24染色體中，對含有290個氨基酸的Ⅰ型跨膜蛋白產(chǎn)生編碼作用[8-9]。當PD-1與PD-L1產(chǎn)生結(jié)合作用后，在受到抗原受體信號轉(zhuǎn)導后，導致PD-1細胞質(zhì)去中兩個酪氨酸信號基序發(fā)生磷酸化，導致其效應T細胞凋亡或者失去其功能，最終實現(xiàn)腫瘤免疫逃逸[10]。臨床研究發(fā)現(xiàn)[11]，PD-L1在多種細胞中廣泛表達，分子量為40 kD，因其受CD274基因編碼，在臨床上又被成為CD274，具有負性調(diào)控免疫反應的作用。目前已有多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1在肺癌中呈現(xiàn)為高表達，傅博等[12]在其研究中發(fā)現(xiàn)PD-L1在肺腺癌組織中低表達，且與患者放化療預后相關；蘇寧等[13]在其研究中證實PD-L1在肺腺癌組織中低表達，且與患者EGFR基因狀態(tài)相關。在本研究中測定PD-L1在肺腺癌組織中的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PD-L1在肺腺癌組織中高表達，且與分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關。

CD8+為T淋巴細胞亞群之一，在細胞毒性T淋巴細胞上表達，參與機體細胞免疫反應，在抗腫瘤免疫反應中具有重要的意義[14-15]。有研究發(fā)現(xiàn)[16]，CD8+T淋巴細胞與多種細胞因子作用后可增強機體免疫功能，進而抑制惡性腫瘤進展。在肺癌組織中CD8+T淋巴細胞可促進IL-7大量產(chǎn)生，活化淋巴細胞因子所激活的殺傷細胞，從而發(fā)揮其腫瘤細胞殺傷功能，阻滯惡性腫瘤生長[17]。傅超等[18]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織CD8+T淋巴細胞與患者預后相關。貢鳴等[19]在其研究中發(fā)現(xiàn)，包括肺癌在內(nèi)的6種常見腫瘤患者在初始治療時均存在CD8+T淋巴細胞高表達現(xiàn)象，且其研究發(fā)現(xiàn)，CD8+T淋巴細胞的升高與患者免疫系統(tǒng)激活，可刺激并分泌期效應細胞因子，進而產(chǎn)生較多的殺傷性淋巴細胞相關。在本研究中測定CD8+T淋巴細胞在肺腺癌組織中的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD8+T淋巴細胞在肺腺癌組織中高表達，且與分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關。

臨床研究發(fā)現(xiàn)[20]，當T細胞表面的PD-1與PD-L1相結(jié)合后，會招募蛋白酪氨酸磷酸酶1、蛋白酪氨酸磷酸酶2，作用于下游信號轉(zhuǎn)導通路，產(chǎn)生阻滯信號，抑制CD4+T細胞增殖，促進CD8+T細胞增殖，進而發(fā)揮其抑制作用。在本研究中分析PD-L1、CD8+T淋巴細胞兩者之間關系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PD-L1、CD8+T淋巴細胞兩者之間呈正相關，此結(jié)果說明，兩者可能共同作用，參與腫瘤免疫逃逸。

綜上所述，PD-L1、CD8+T淋巴細胞在肺腺癌組織中高表達，與患者疾病分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關，且兩者呈正相關，共同參與此病的發(fā)展。