IL-38對類風濕關節炎患者輔助性 T 細胞17轉錄因子的影響*

張繼云,王梅,趙旌,李文艷

新疆醫科大學第二附屬醫院風濕免疫科(新疆烏魯木齊 830000)

類風濕關節炎(rheumatiod arthritis，RA)是一種以持續性滑膜炎癥為特征的異質性慢性自身免疫性疾病，病因不明，可能由感染和組織損傷等未知起始事件引起，各種炎性細胞因子造成關節疼痛腫脹及系統損害等炎癥過程，進而導致軟骨和骨質破壞[1]。目前已經證實輔助性 T 細胞17(Th17)細胞在RA中起關鍵性作用，屬于CD4+T 細胞的一類亞群，因其分泌白細胞介素-17(IL-17)，所以被稱之為 Th17細胞[2]。信號轉錄和轉導因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)與轉錄因子維甲酸相關孤兒受體C(retinoic acid-related orphan receptor C，RORC)是Th17細胞重要的轉錄因子，通過經典的JAK/STAT3信號傳導通路活化，促進Th17細胞分化[3]，導致關節滑膜增殖、軟骨侵蝕和全身性的炎癥反應，從而引發RA的發病[4-5]。白細胞介素(interleukin,IL)-38是近年來新發現的一種細胞因子，隸屬于IL-1家族(IL-1 family，IL-1F)，在2001年被命名為IL-1HY2[6]。IL-38在多種組織中表達，如心臟、胎盤、嬰兒肝臟、皮膚、脾臟、胸腺以及扁桃體上增殖的B細胞中表達。最近的研究表明，IL-38與慢性炎癥性疾病，特別是風濕免疫性疾病，如系統性紅斑狼瘡(SLE)[7-8]、RA[9-10]、銀屑病[9,11]和炎性腸病(IBD)有密切的聯系[9]。在我們的前期研究中發現，在RA患者體內IL-38通過調控Th17細胞數量及相關細胞因子的分泌，參與了RA的發生、發展[12]。但其具體機制尚不清楚，在本研究中，通過觀察RA患者IL-38對Th17細胞轉錄因子的影響，從而深入探討IL-38在RA發病機制中的作用，評估IL-38作為RA臨床生物標志物的潛力。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集新疆醫科大學第二附屬醫院風濕免疫科2016年1—4月RA患者30例，年齡28～58歲，平均(34.2±9.6)歲，其中女19例，男11例，診斷均符合1997年美國風濕病學院修訂的RA分類標準；30例新疆醫科大學第二附屬醫院體檢中心的健康人群作為正常對照組，年齡30～60歲，平均(36±8.5)歲，其中女20例，男10例，均無風濕病史和風濕病家族史。兩組間年齡、性別差異均無統計學意義(P>0.05)。所有患者知情同意后，獲取血液標本。

1.2 實驗方法

1.2.1 外周血單個核細胞(peripheral blood monocytes，PBMCs)分離、培養 采集肝素抗凝外周血5 mL，3 000 r/min，離心10 min，吸取上層血清，-80℃凍存，待ELISA檢測；向淋巴細胞分離液中加入2倍稀釋的血漿分離PBMCs計數，向5×105PBMCs中加人0.5 mL含10%胎牛血清的RPMI1640培養液，置24孔板中培養，加入5 μg/mL PHA，其中一組中加入50 ng/mL人重組IL-38，置體積分數為5%CO2、37℃飽和濕度培養72 h。

1.2.2 酶聯免疫吸附試驗(ELISA) 將血漿標本從-80℃冰箱取出，室溫下融化，將試劑盒從冷藏室拿出，室溫放置15 min。采用IL-38檢測試劑盒、RT-6100酶標分析儀，嚴格按照試劑盒及儀器操作說明對樣本進行檢測。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR) Trizol法抽提總RNA，用含反轉錄酶PrimeScriptTMRTase逆轉錄酶試劑盒將RNA逆轉錄cDNA，-70℃保存。在ABI Prism 7500測序儀上以cDNA為模版利用DNA聚合酶TaKaRa EX TapTMHS進行實時定量PCR擴增反應，具體操作參照SYBR PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒說明書進行。以SDS2.0(PE Biosystem)軟件分析各孔Ct值(模板拷貝數擴增到指數上升期所需反應循環數大小,Ct值越大,拷貝數越少)。以GAPDH作為內參，將Ct值減去GAPDH Ct值作為ΔCt值。ΔCt值越低，則表達水平越高。計算標準化后2-ΔΔCt值表示mRNA 的相對表達量。

2 結果

2.1 RA組和正常對照組IL-38表達水平的比較 實時熒光定量PCR結果顯示RA患者IL-38基因表達水平(2.92±1.96)顯著低于正常對照組(5.79±3.55)，差異有統計學意義(Z=-1.28，P<0.05)；RA患者IL-38蛋白表達水平(0.44±0.03)顯著低于正常對照組(0.72±0.58)，差異有統計學意義(Z=-1.59，P<0.05)；

2.2 RA組和正常對照組RORC mRNA表達水平的比較 RA患者RORC mRNA(6.29±3.98)顯著高于正常對照組(1.6±0.95)，差異有統計學意義(Z=-1.36,P<0.05)；且RORC mRNA表達水平與IL-38水平呈負相關(r=-0.31，P<0.05)。

2.3 RA組和正常對照組STAT3 mRNA表達水平的比較 RA患者STAT3 mRNA(2.72±2.11)顯著高于正常對照組(0.69±0.67)，差異有統計學意義(Z=-1.24,P<0.05)；且STAT3 mRNA表達水平與IL-38水平呈負相關(r=-0.25，P<0.05)；

2.4 IL-38對轉錄因子STAT3表達水平的影響 在體外實驗中，RA患者外周血中加入IL-38后，RORC基因表達水平(1.87±1.59)較RA患者(6.29±3.98)明顯下降，差異有統計學意義(Z=-1.48,P<0.05)。

2.5 IL-38對轉錄因子RORC mRNA表達水平的影響 在體外實驗中，RA患者外周血中加入IL-38后，STAT3基因表達水平(0.58±0.13)較RA患者(2.72±2.11)明顯下降，差異有統計學意義(Z=-1.37,P<0.05)。

3 討論

RA是一種以與炎癥環境相聯系的嚴重關節炎癥和破壞為特征的自身免疫性疾病[13]。疾病的發展伴隨著滑膜細胞增生、新生血管形成，以及局部大量T細胞浸潤。如果不經過正規治療，病情會逐漸發展，最終導致關節畸形、功能喪失，具有很高的致殘率。據報道IL-38基因多態性與脊柱炎、RA和銀屑病性關節炎易感性相關[14-16]。此外，實驗研究發現IL-38的過度表達或敲除參與了自身免疫性疾病的發病[8,17-18]。由于炎性細胞因子與慢性炎癥性疾病在多個層面上具有緊密的聯系，結合最近IL-38相關性的研究結果，使得IL-38在炎癥性疾病中的調節能力而受到關注。

本研究通過比較RA患者和對照組外周血IL-38水平，我們發現RA患者IL-38表達水平明顯低于健康對照組，基于目前的多項研究報道IL-38是一種抗炎因子，可能是經由自分泌或旁分泌通路釋放發揮免疫抑制作用，說明在RA患者體內IL-38分泌減少，不能發揮與受體結合以及調節炎癥細胞因子的生成作用，從而參與了機體RA的發生、發展。我們前期報道了RA患者IL-38表達水平與Th17細胞數量及IL-17濃度均呈負相關，且IL-38能夠抑制Th17細胞的增殖[12]。為進一步明確IL-38對RA患者Th17細胞的調控機制，我們檢測RA患者組和健康對照組Th17細胞轉錄因子RORC、STAT3表達水平，結果顯示RA患者RORC、STAT3表達水平顯著高于對照組，并且分別與IL-38水平呈負相關，說明IL-38與RORC、STAT3具有一定的相關性。在體外實驗中，將IL-38加入RA患者外周血中，發現外周血中RORC、STAT3 mRNA表達水平較前下降，提示IL-38能夠抑制RORC、STAT3的表達，綜合以上結果，我們推測IL-38通過抑制Th17細胞轉錄因子RORC、STAT3的轉錄表達，進而降低了Th17細胞的活化，導致了RA的發病。

IL-38首次被發現距今已經17年，但是目前對于IL-38的認識仍然很少。IL-38屬于IL-1F，大部分IL-1F亞家族被認為是炎性細胞因子，能夠調節炎癥性疾病相關基因的表達。通過我們以上的研究發現，IL-38能夠通過調控Th17細胞轉錄因子RORC、STAT3的表達，造成Th17細胞的分化成熟障礙，最終通過抑制炎性細胞因子的分泌達到抑制炎癥的作用。因此，對IL-38的研究將有助于在治療RA疾病中發掘新靶點。