Meis1 和Cyclin D3在子宮內膜癌中的表達及臨床意義*

王茂彩,李驍,陳姍,陳勍

1中山大學附屬第六醫院婦科(廣東廣州 510065)；2中山大學孫逸仙紀念醫院婦產科(廣東廣州 510042)

子宮內膜癌(endometrial carcinoma,EMC)是一種最常見的女性生殖道惡性腫瘤。研究表明，子宮內膜癌的發生、發展與癌基因的激活和抑癌基因的失活有著一定的關系[1]。粒細胞嗜酸性白血病整合位點1(myeloid ecotropic leukemia integration site-1，Meis1)屬于同源盒(homeodomain box，HOX)基因的三氨基酸環延伸家族(three amino acid length)，通過與HOX蛋白以及其他轉錄因子的相互作用而發揮其調節細胞活性的作用[2]。細胞周期蛋白D3(Cyclin D3)是細胞G1/S期的正性調控因子，有誘導細胞自主分裂，誘發癌變的作用，在子宮內膜癌、食管鱗癌、卵巢癌等多種癌中過表達[3-4]。既往在白血病相關研究中表明抑制meis1基因的轉錄，降低了Cyclin D3水平，阻止了細胞從G1期到S期的進程，說明Meis1的生長促進活性可能與細胞周期蛋白D-pRb細胞周期控制途徑有關[5]。本研究擬聯合檢測Meis1與Cyclin D3在子宮內膜樣腺癌組織中的蛋白表達情況，初步探討在子宮內膜癌中的Meis1的表達是否異常，并與Cyclin D3的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2003年1月至2010年12月在中山大學孫逸仙紀念醫院婦科住院治療的45例子宮內膜癌患者的相關臨床資料，均因“子宮內膜樣腺癌”行根治性或姑息手術切除子宮。所有患者術前均未接受化療、放療及任何激素等治療。患者年齡21～74歲，平均(54.0±9.4)歲。其中高分化腺癌19例，中分化腺癌14例，低分化癌12例，病理標本均經病理科醫師復核確診。并收集12例因其他良性病變切除子宮的患者的正常子宮內膜作為對照組。年齡30～49歲，平均(40.8±7.3)歲，無其他系統性疾病，近期未服用任何激素類藥物。本研究已通過醫院倫理委員會批準，所有入組患者或其家屬均已簽署書面知情同意書。整理和收集患者的相關臨床資料信息，如患者年齡、孕產次、放化療史、病理分型等。

1.2 方法

1.2.1 取材的方法 12例正常子宮內膜及45例子宮內膜癌患者的子宮內膜標本均來源于切除的子宮，子宮切除后，將子宮標本進行固定，并送石蠟病理。在病理結果證實子宮內膜腺癌的標本中，進行免疫組化檢查。

1.2.2 免疫組化 采用非生物素二步法免疫組化染色。先用10%甲醛固定的子宮內膜標本，石蠟包埋后切片(4 μm)，繼而脫蠟、酒精水化、修復抗原等；滴加Meis1多克隆抗體(1∶25,ABCAM company)或Cylin D3多克隆抗體(1∶50,奧博森)，予PV-6001(兔IgG抗體-HRP多聚體、中杉金橋)處理，沖洗，脫水、封片。取Cyclin D3及Meis1蛋白表達陽性的子宮內膜切片作為陽性對照，采用PBS(中杉金橋)代替一抗作為陰性對照。以腺上皮細胞中出現黃色至棕黃色顆粒為陽性。在光鏡下計數400個細胞，采用雙評分半定量法進行評價。陽性細胞數<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分；顯色度評分：細胞核無顯色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。兩項評分相加：0分為陰性(-)，1～2分為低表達(+)，3～4分為中表達(++)，5～6分為高表達(+++)。陽性表達率計算公式為：(中表達例數+高表達例數)/組例數×100%。

1.3 統計學方法 使用SPSS 26.0統計軟件，對于率的比較采用2檢驗，如不符合四格表2檢驗的條件(T>5，且n>40)，應用Fihsher確切概率法。采用spearman相關分析Meis1、Cyclin D3在子宮內膜樣腺癌中的陽性表達率之間的關系。采用Log-rank (Mantel-Cox) 分析Meis1和Cyclin D3表達與子宮內膜癌患者生存時間關系。

2 結果

2.1 Meis1在不同子宮內膜組織中的表達情況 Meis1在正常子宮內膜、子宮內膜樣腺癌組織中均可呈現陽性表達，而且主要表達于細胞胞漿中，細胞排列紊亂，細胞核大，細胞核中未見明顯表達，見圖1。

12例正常子宮內膜組織中，1例Meis1為中表達，11例為陰性或低表達，陽性表達率為8.3%(1/12)。45例子宮內膜樣腺癌組織中，18例Meis1為陽性表達(13例中表達、5例高表達)，陽性表達率為40%(18/45)，其中，高分化組、中分化組和低分化組中分別有52.6%(10/19)、42.9%(6/14)和16.7%(2/12)呈陽性表達。見圖1，表1。

表1 Meis1在正常子宮內膜及子宮內膜樣腺癌亞組之間的表達情況 例(%)

2.2 Cyclin D3在正常子宮內膜、子宮內膜癌中的陽性表達情況 Cyclin D3子宮內膜癌組織中主要在腺癌細胞中呈現陽性表達，位于胞漿中，呈淡黃或棕黃色，細胞排列不整齊，細胞漿腫脹，細胞核大，細胞核中呈陰性表達。見圖2，表2～3。

12例正常子宮內膜組織中，4例Cyclin D3為陽性表達(2例為中表達，2例高表達)，陽性表達率為33.3%(4/12)。45例子宮內膜樣腺癌患者的組織中，35例呈Cyclin D3陽性表達(24例為中表達，11例高表達)，陽性表達率為77.8%(35/45)。正常子宮內膜與子宮內膜樣腺癌患者之間的表達差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 Cyclin D3在正常子宮內膜、子宮內膜樣腺癌亞組中的表達 例(%)

2.3 Meis1與Cyclin D3在子宮內膜樣腺癌組織中表達的相互關系 45例子宮內膜癌組織中，37.78%(17/45)Cyclin D3與Meis1均同時為陽性表達，Cyclin D3與Meis1均同時為陰性表達的20.00%(9/45)。在子宮內膜樣腺癌組織中，Cyclin D3與Meis1的蛋白表達之間呈正相關(r=0.327,P<0.05)。見表3。

表3 Meis1與Cyclin D3在子宮內膜癌組織中表達的相互關系 例

2.4 Meis1與Cyclin D3表達與子宮內膜癌患者預后關系 45例內膜組織中，Meis1陽性表達患者(n=18)的平均生存時間為35.33個月，陰性表達患者(n=27)的平均生存時間為50.93個月，差異有統計學意義(2=11.22，P=0.000 8) 。Meis1陽性表達和陰性表達患者生存曲線見圖3。45例內膜組織中，Cyclin D3陽性表達患者(n=35)的平均生存時間為43.89個月，陰性表達患者(n=27)的平均生存時間為47.5個月，差異有統計學意義(2=5.331，P=0.021 0) 。Cyclin D3陽性表達和陰性表達患者生存曲線見圖4。

注：A:Meis1正常子宮內膜組織;B:子宮內膜腺癌組織(高分化組);C:子宮內膜腺癌組織(中分化組);D:子宮內膜腺癌組織(低分化組) (免疫組化，×200)

注：A:正常子宮內膜組織；B:子宮內膜腺癌組織(高分化組) ；C:子宮內膜腺癌組織(中分化組)；D:子宮內膜腺癌組織(低分化組)

圖3 Meis1陽性表達和陰性表達患者生存曲線

圖4 Cyclin D3陽性表達和陰性表達患者生存曲線

3 討論

子宮內膜樣腺癌是子宮內膜癌最常見的病理類型，其發病率逐年升高并有年輕化的趨勢，對女性身體健康和生殖健康造成巨大威脅。子宮內膜癌與其他惡性腫瘤一樣，本質是細胞生長周期調節失控，細胞呈無限制、自主增生和分裂，已知的影響子宮內膜癌細胞調控的相關基因主要包括PTEN、P27、P53、P16等，但具體機制尚不明確[1]。由于子宮內膜癌的早期篩查尚不成熟，分離和鑒定癌基因與抑癌基因對于子宮內膜癌的基因研究和早期篩查治療都具有重要的意義。

Meis1基因廣泛表達于多種正常造血組織中，如骨髓造血干細胞(HSCs)[6]，而同源框基因(HOX基因) 是一類控制胚胎發育和細胞分化的調節基因。在白血病中，HOXA9和MEIS1被認為是混合譜系白血病(MLL)融合的最關鍵目標，它們的共表達可快速誘導急性髓細胞白血病(AML)[7]。但是在前列腺癌研究中，MEIS1-HOXB13轉錄調控抑制前列腺癌增殖和轉移[8]。在正常子宮內膜中meis1也有表達[9]。本研究觀察到正常子宮內膜中meis1在基質細胞胞核中的表達強于腺上皮細胞，在腺上皮細胞胞核meis1陽性表達率為8.3%，明顯低于子宮內膜樣腺癌組(40%)(P<0.05)。初步說明meis的過表達可能是子宮內膜癌發生的一個因素。根據腺癌細胞分化級別進一步比較，雖然組間差異有統計學意義，但是兩兩比較差異無統計學意義。不排除樣本量較少影響統計分析可能。

Cyclin D3是一種原癌基因，是細胞G1/S期的正調控因子，其參與并促進細胞自主分裂，誘發細胞癌變，與惡性腫瘤的發生、發展有著密切的關系[10]。臨床研究表明，Cyclin D3在子宮內膜癌組織中呈現過表達[11]。本研究中子宮內膜腺癌中Cyclin D3的表達高于正常子宮內膜(77.8%vs33.3%,P<0.05)。根據腺癌分化級別分組后兩兩比較，高分化組、中風化組與正常子宮內膜組、低分化組間陽性表達差異有統計學意義。既往研究表明，不同亞型的細胞周期蛋白(cyclin D1[12]、cyclinA[13]、cyclin[14]等)均在子宮內膜癌中過表達，我們認為子宮內膜樣腺癌細胞的無限增殖不是一種細胞周期蛋白過度表達的結果，而可能是多種細胞周期蛋白過表達異常的共同結果。

本研究結果顯示，Meis1和CyclinD3在子宮內膜癌組織中的陽性表達率分別為40%(18/45)和77.8%(35/45)，而且有37.78%(17/45)的患者Cyclin D3與Meis1均同時為陽性表達，20%(9/45)的患者均同時為陰性表達。兩者經配對2檢驗提示存在正相關(2=16.564，P<0.05)。進一步分析顯示，Meis1和Cyclin D3陽性表達患者的平均生存時間明顯低于陰性表達組患者，提示Meis1和Cyclin D3陽性表達的子宮內膜癌患者生存時間短，預后較差。既往白血病研究中，通過抑制meis1基因轉錄，可降低Cyclin D3水平，說明Meis1的生長促進活性可能通過調控與細胞周期蛋白D-pRb細胞周期有關[5]。Meis1可能通過促進cyclinD3的表達來共同參與子宮內膜樣腺癌的增殖。