SATB1通過PI3K/Akt信號通路在哌立福新對胃癌失巢凋亡抵抗細胞作用機制中的研究①

秦玉萍 高迎新 馬熙萌 杜 瑤 王 新 禹 莉

(蚌埠醫學院腫瘤基礎研究與臨床檢驗診斷重點實驗室，蚌埠 233030)

流行病學資料顯示，胃癌是危害人類健康最常見的惡性腫瘤之一[1-2]。我國胃癌發病率一直呈上升和年輕化趨勢，死亡率高，預后差，確診后5年生存率僅為20%～30%[3]。胃癌惡性侵襲和轉移是造成其預后不良的主要原因。在以手術為主，以放化療為輔的傳統方式治療胃癌預后效果不佳的情況下，明確胃癌發病機制，控制胃癌的侵襲及轉移十分重要。

失巢凋亡能使正常細胞在增殖、分化和凋亡過程中保持動態平衡，而失巢凋亡抵抗是惡性細胞的一個特征，在腫瘤轉移中起重要作用[4]。研究表明，在腫瘤細胞對凋亡抵抗的過程中，涉及多種信號轉導。如磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路不僅調節腫瘤細胞的增殖與活化，還影響腫瘤細胞的侵襲、遷移、細胞外基質的降解以及腫瘤血管生成等[5-6]。最近研究表明PI3K/Akt信號通路與胃癌發生、發展密切相關[7]。這一信號通路的激活可能是腫瘤細胞抵抗失巢凋亡的主要機制之一[6]。哌立福新是一種合成的烷基磷脂化合物，是Akt的特異性抑制劑[8-9]。在復發或者難治性多發性骨髓瘤中已行Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗，并取得較好效果，準備進入第Ⅲ期臨床試驗，哌立福新治療侵襲性結直腸癌、復發性膠質母細胞瘤也已進入Ⅱ期臨床試驗階段[10-13]。因此哌立福新在研究PI3K/Akt信號通路在腫瘤中的作用有重要意義。

特異AT序列結合蛋白1(special AT-rich sequence-binding protein 1，SATB1)通過影響染色質的結構組織，與多種轉錄共激活子和共同抑制因子的相互作用，影響腫瘤生物學行為。并且與腫瘤生長、轉移以及臨床病理特征如TNM分期增加、腫瘤分化減少和總生存期縮短相關，因此SATB1的表達被確定為各種癌癥的獨立預后標志物[14]。此外，基因敲除或異位過度表達策略已證實SATB1可影響細胞增殖、細胞周期、凋亡、細胞形態/細胞極性、EMT、多藥耐藥性以及腫瘤的形成、生長、侵襲和轉移[15]。

既然PI3K/Akt信號轉導通路的活化及SATB1基因表達的上調在腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移中扮演著重要的角色，而失巢凋亡抵抗又與腫瘤細胞的存活和轉移密切相關。那么，胃癌細胞的存活和轉移是否也與上述分子事件有關聯？發生了失巢凋亡抵抗的胃癌細胞，其生物學行為特性是否隨之發生改變？抑制PI3K/Akt信號傳導通路及干擾SATB1基因的表達對胃癌細胞抗失巢凋亡能力又有什么影響？本研究建立了胃癌AGS失巢凋亡抵抗細胞模型，檢測哌立福新對其PI3K/Akt信號通路活性及細胞生物學行為的影響，從分子生物學水平檢測靶向抑制劑對胃癌失巢凋亡抵抗細胞關鍵信號分子的作用，從而為抗腫瘤靶向藥物的臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1材料 人胃癌細胞系AGS購自上海細胞庫；RPMI1640細胞培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自上海貝博生物科技公司；胰酶細胞消化液、二喹啉甲酸BCA蛋白濃度測定試劑盒、結晶紫染色液、RIPA裂解液購自碧云天生物技術公司；基質膠(Matrigel)、Transwell小室購自美國Corning公司；Poly-HEMA購自美國Sigma公司；哌立福新購自上海一基實業有限公司；Akt、p-Akt、PTEN、MMP-2、SATB1、Vimentin、Slug、E-cadherin、β-actin購自美國CST公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔 IgG購自美國Abclonal公司；PVDF膜、ECL化學發光試劑盒購自美國Millipore公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 人胃癌細胞系AGS培養于含10%FBS和1%青霉素/鏈霉素新鮮的RPMI1640細胞培養基中，在37℃和5%CO2的細胞培養箱中培養至對數期。取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2超低黏附培養板制備 將1.2 g poly-HEMA溶解于無水乙醇中，60℃加熱振蕩過夜，制備成120 mg/ml Poly-HEMA貯存溶液，臨用前，用無水乙醇按1∶9 稀釋成12 mg/ml的工作液。6孔板每孔加入1 ml工作液鋪板，待其干燥充分凝固后，追加0.5 ml溶液重新包被，制備成超低黏附培養板。用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，紫外線消毒，4℃冰箱保存備用。使用前紫外線再次照射1 h。

1.2.3胃癌細胞失巢凋亡培養 用0.25%胰蛋白酶消化收集對數生長期AGS細胞，制成單細胞懸液，平分到Poly-HEMA包被處理的6孔培養板中。將6孔板置于搖床上，37℃，5% CO2環境中孵育。隔日換液，換液方法：將細胞用吸管移入離心管中，500 r/min，離心5 min，棄上清，加新鮮RPMI1640培養基重懸，將細胞懸液加入6孔板中繼續培養。以上方法懸浮培養AGS細胞10 d，模擬胃癌細胞脫離周圍細胞或細胞外基質的狀態。收集到15 ml 的離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入新鮮培養基重懸，將細胞懸液置于普通培養瓶中重貼壁培養3 d，待長成單層，即可誘導獲得胃癌失巢凋亡抵抗AGS細胞，而用于誘導的細胞稱為胃癌親本細胞。胃癌失巢凋亡抵抗細胞重貼壁培養后換液、傳代方法與親本AGS細胞相同。為保證誘導獲得的胃癌失巢凋亡抵抗細胞在生物學特性方面的穩定性，每項實驗開始前2周就開始誘導，獲得胃癌失巢凋亡抵抗細胞后就進行相關實驗，避免胃癌失巢凋亡抵抗細胞多次傳代。

1.2.4MTT法檢測細胞增殖能力 在96孔板中以4×103個/孔接種200 μl胃癌失巢凋亡抵抗AGS細胞懸液。37℃，5%CO2濃度培養24 h，分別加入0、1、2、3、4、5 μmol/L哌立福新作用24 h，空白對照組(只添加培養基)。用20 μl MTT(5 mg/ml)孵育 4 h，丟棄培養基，每孔加入200 μl二甲基亞砜，避光振蕩10 min，待藍紫色結晶充分溶解后，酶標儀讀取吸光度值。每組實驗重復3次，每次設5個平行孔。

1.2.5細胞克隆形成實驗 將胃癌親本AGS細胞和失巢凋亡抵抗AGS 細胞以1 000個/孔接種于6孔板中，培養箱中培養14 d，隔日觀察細胞生長情況，定時換液。出現肉眼可見的細胞時，棄去培養液，PBS洗3遍，4%多聚甲醛溶液固定細胞30 min。結晶紫染20 min。倒置顯微鏡下觀察細胞集落，計克隆形成數目。

1.2.6Annexin-V/PI染色法檢測細胞凋亡 收集細胞，用冷PBS洗滌2次，用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒中的結合緩沖液300 μl重新懸浮細胞，靜置5～10 min。然后與Annexin V-FITC室溫下避光孵育15 min，與PI在4℃避光靜置 10 min，流式細胞儀測定細胞凋亡率。每組樣本各設 3 個復孔。

1.2.7Wright-Giemsa染色 失巢凋亡抵抗AGS細胞接種于6孔板中孵育 24 h，然后用哌立福新處理24 h，取出蓋玻片晾干。Wright-Giemsa染色法對細胞進行染色，光學顯微鏡下觀察細胞形態并拍照。

1.2.8細胞劃痕實驗 將失巢凋亡抵抗AGS細胞鋪于6孔板中培養 24 h 后，用移液槍10 μl槍頭在培養板中劃直線，PBS洗滌3遍，將滑落的細胞洗掉，處理細胞后繼續培養20 h，PBS洗滌去除懸浮細胞，分別于0 h和20 h在10倍倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.9Transwell小室法檢測細胞遷移和侵襲 侵襲實驗與遷移實驗方法類似，區別僅是侵襲實驗前用Matrigel基質膠包被Transwell小室上層。用無血清培養液重懸細胞，調整細胞密度為3×105個/ml，取100 μl接種于上室，下室加入含10% FBS的完全培養基600 μl，然后將Transwell小室放入培養箱中培養24 h后取出小室，棉簽擦去上層未穿過小室膜的細胞，4%多聚甲醛溶液固定，結晶紫染色，PBS清洗2～3次，風干后置于倒置顯微鏡下拍照采圖，隨機選取5個視野，計數穿過小室膜的細胞數量，反映細胞遷移和侵襲能力。

1.2.10qRT-PCR檢測 按說明書用TRIzol試劑從細胞中提取總RNA，用PrimeScript RT試劑盒進行反轉錄反應合成cDNA。qRT-PCR采用SYBR Primix EX TaqTMⅡ試劑盒檢測，反應體系和擴增條件參考說明書進行操作。靶基因和β-actin的引物序列見表1。用2-ΔΔCt計算相對表達量。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.2.11Western blot檢測蛋白表達 收集各組細胞，用含1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，提取總蛋白，使用BCA 法進行蛋白定量，10% SDS-PAGE 凝膠電泳使蛋白分離，將蛋白轉至 PVDF膜上，5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗4℃孵育過夜，TBST 洗膜 3遍，每次洗滌10 min，辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，TBST 洗膜 3遍，用ECL化學發光試劑盒、Bio-Rad公司凝膠成像儀顯影，Imagelab圖像分析軟件測定條帶灰度值，β-actin為內參，分析蛋白質的相對表達量。

2 結果

2.1胃癌失巢凋亡抵抗細胞模型的建立 在倒置相差顯微鏡下觀察到，貼壁培養的人胃癌AGS細胞接種入培養板時，最初為單個分散細胞，呈小圓形。培養48 h～72 h后，細胞單層生長，排列整齊，胞體飽滿呈多邊形，大小均一(圖1A)；當AGS細胞接種超低黏附培養板進行懸浮培養時，最初亦為呈小圓形的單個分散細胞(圖1B)，其貼壁狀態明顯變差，生長緩慢，細胞邊緣不整，隨著時間推移，細胞逐漸聚集成簇，細胞簇在一段時間內不斷增大，48 h 后可見細胞逐漸成團(圖1C)，隨后形成大而松散的珊瑚狀細胞團(圖1D)。懸浮培養10 d后，收集細胞接種于普通培養板中重貼壁培養，細胞形態，由原來親本細胞貼壁生長時排列整齊、形狀規則的多邊形變成有較多突起、排列紊亂的不規則多角形(圖1E)，但多次傳代后，細胞形態逐漸恢復正常(圖1F)。重貼壁細胞即為胃癌失巢凋亡抵抗AGS細胞。

圖1 倒置相差顯微鏡下觀察人胃癌AGS細胞在不同培養方式下的形態學變化

2.2失巢凋亡抵抗抑制細胞凋亡，促進細胞增殖和遷移，上調轉移相關基因 克隆形成實驗結果顯示，失巢凋亡抵抗AGS細胞較親本細胞增殖能力增強(圖2A)。Annexin V/PI染色顯示細胞凋亡減少(圖2B)。Transwell和細胞劃痕實驗結果顯示，與親代細胞相比，失巢凋亡抵抗AGS細胞侵襲和遷移能力增強(圖2C～D)。Western blot結果顯示，失巢凋亡抵抗AGS細胞中p-Akt、MMP-2和SATB1的表達上調，PTEN的表達較親代細胞下調，而兩者的Akt無顯著差異(圖2E)。

圖2 失巢凋亡抵抗抑制胃癌AGS細胞凋亡，促進細胞增殖和遷移

2.3哌立福新抑制凋亡抵抗AGS細胞增殖，促進細胞凋亡 MTT法檢測細胞活力，結果顯示，當凋亡抵抗AGS細胞暴露于不同濃度的哌立福新時，細胞生長呈濃度依賴性抑制作用，細胞活力呈逐漸下降趨勢(圖3A)。流式細胞術檢測細胞凋亡結果顯示，與對照組相比，實驗組的凋亡率隨著濃度的增加而顯著升高(P<0.05，圖3B)。Wright-Giemsa染色結果顯示：對照組AGS細胞胞漿清晰，顆粒少，細胞結構緊密，排列規則，懸浮細胞稀少，細胞增殖能力強。哌立福新組隨著濃度的增加，細胞增殖減慢，培養基中漂浮細胞數量增多，細胞數量逐漸減少，黏附能力減弱。并且細胞逐漸變圓，碎片逐漸增多，細胞中的顆粒越來越多(圖3C)。

圖3 哌立福新抑制凋亡抵抗AGS細胞增殖，促進細胞凋亡

2.4哌立福新抑制凋亡抵抗AGS細胞侵襲、遷移能力 Transwell和細胞劃痕實驗表明：與0 μmol/L組相比，哌立福新組穿過小室膜的細胞數量減少(圖4A)，劃痕閉合率明顯降低(圖4B)(P<0.05或P<0.01)。哌立福新能明顯抑制凋亡抵抗AGS細胞的侵襲和遷移能力。

圖4 哌立福新抑制凋亡抵抗AGS細胞侵襲、遷移能力

2.5哌立福新對凋亡抵抗AGS細胞PIK3CA、AKT和PTEN基因表達的影響 qRT-PCR檢測結果顯示：與0 μmol/L組相比，凋亡抵抗 AGS細胞中PIK3CA mRNA、Akt mRNA的表達隨著哌立福新濃度的增加而降低，PTEN mRNA表達在3 μmol/L哌立福新時顯著增加(圖5)。

圖5 qRT-PCR基因表達的相對定量分析

2.6哌立福新對凋亡抵抗AGS細胞Akt、p-Akt、PTEN、MMP-2和STAB1蛋白表達的影響 Western blot檢測凋亡抵抗AGS細胞中蛋白表達水平，結果顯示，與對照組相比，p-Akt、MMP-2、STAB1蛋白表達顯著降低，PTEN表達顯著增加，Akt表達無統計學意義(圖6)。

圖6 哌立福新對失巢凋亡抵抗AGS細胞蛋白質表達的影響

2.7下調SATB1增強哌立福新介導的腫瘤抑制效應 為進一步研究SATB1在哌立福新介導的抗腫瘤效應中的作用，通過SATB1 siRNA轉染凋亡抵抗AGS細胞，Western blot檢測結果表明，轉染后SATB1表達明顯下調(圖7A)，MTT數據分析表明，siRNA干擾SATB1表達能抑制凋亡抵抗AGS細胞的增殖，而且下調SATB1能增強哌立福新介導的細胞生長抑制(圖7B)。流式細胞儀檢測結果顯示，下調SATB1能誘導凋亡抵抗AGS細胞的凋亡，而且能增強哌立福新誘導的細胞凋亡(圖7C)。Transwell結果表明，下調SATB1能抑制凋亡抵抗AGS細胞的侵襲及遷移，而且能使哌立福新抑制細胞侵襲及遷移的作用增強(圖8)。表明SATB1在哌立福新對凋亡抵抗AGS細胞的抗腫瘤活性中起著關鍵作用。

圖7 下調SATB1增強哌立福新介導的腫瘤抑制效應

圖8 下調SATB1使哌立福新抑制細胞侵襲及遷移的作用增強

3 討論

細胞外基質是細胞生長和分化的基膜，當正常細胞脫離細胞粘附的細胞外基質，便失去與其他細胞或細胞外基質之間的聯結，通常會引發細胞凋亡，又稱為失巢凋亡，這是一種程序化細胞死亡形式，使調節細胞與基質之間正常細胞存活的信號被中斷，失巢凋亡能使正常細胞在增殖、分化與凋亡中保持動態平衡，從而能確保細胞和組織內環境的穩態，其在機體正常發育、保持組織自身平衡、疾病的發病機制和腫瘤的轉移中起著重要作用[16-17]。然而，許多腫瘤細胞由于獲得失巢凋亡抵抗能力，可以在非錨定依賴條件下生存和生長，也就是說這些細胞在脫離原發腫瘤灶并通過血管或淋巴管侵入或遷移到遠處轉移部位時，可以在缺乏黏附的情況下存活[18-20]。腫瘤細胞具有抵抗失巢凋亡、侵襲和遷移能力強的特點，也是腫瘤發生轉移的重要原因之一[21]。研究表明，胃癌的發生發展與失巢凋亡抵抗密切相關[22-25]。然而，確切的發病機制仍不清楚。

在以往的研究中，懸浮培養貼壁細胞通常用于建立失巢凋亡抵抗細胞模型[19-20]。課題組超低黏附培養板上懸浮培養胃癌AGS細胞一段時間后，再貼壁培養，存活下來的細胞被認為是凋亡抵抗細胞。結果顯示，失巢凋亡抵抗AGS細胞比親代細胞生長更快，凋亡率更低。Transwell實驗和劃痕實驗均表明凋亡抵抗AGS細胞具有更強的侵襲和遷移能力。

近年來針對癌轉移治療的主要方法是分子靶向治療。因此，識別新的靶分子對于提高胃癌治療的臨床療效具有重要意義。許多信號轉導途徑及相關基因與腫瘤的抗失巢凋亡和轉移過程有關。研究表明PI3K-Akt信號通路在上皮性卵巢癌、胃腸道癌、非小細胞肺癌、肝細胞癌等多種腫瘤中都有明顯的激活作用[26-29]。PI3K-Akt信號通路的激活可影響多種與腫瘤細胞生存和轉移相關基因的表達，抑制多種刺激誘導的細胞凋亡，促進細胞生存和增殖，參與腫瘤血管生成、腫瘤侵襲和轉移[30-31]。與以上報道一致，本次研究表明凋亡抵抗AGS細胞中PIK3CA、p-Akt、SATB1和MMP-2的表達增加。證實了PI3K/Akt通路的激活或過度表達可能促進胃癌細胞對失巢凋亡的抵抗。活化的Akt與AGS細胞對失巢凋亡的抵抗有關，并影響SATB1和MMP-2基因的表達，促進了AGS細胞的轉移潛能。從而獲得對失巢凋亡的抵抗會導致細胞外基質的重塑和PI3K/Akt通路成分的過度表達。因此，PI3K/Akt通路與AGS細胞的抗凋亡能力和胃癌的轉移潛能有關。

有研究表明PTEN在多種腫瘤細胞的增殖和侵襲中起著重要的調節作用。PTEN的丟失在許多腫瘤中很常見。因此，PTEN被認為是一種癌癥抑制因子[32]。PTEN是一種兼有脂質磷酸酶活性和蛋白質磷酸酶活性的雙特異性磷酸酶。通過將磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3)轉化為磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)，對PI3K/Akt信號傳導活性具有負調控作用，能拮抗PI3K活性[33]。研究表明PTEN在凋亡抵抗AGS細胞中的表達減少，而PIK3CA的表達增加，這可能與凋亡抵抗AGS細胞的增殖和侵襲有關。

哌立福新是一種新合成的烷基磷脂類化合物，它作為PI3K/Akt途徑的抑制劑，具有抗腫瘤作用，Akt是哌立福新作用的重要細胞靶點[34]。Akt是一種調節細胞凋亡和存活的胞質信號轉導蛋白。在生理狀態下，Akt存在于低活性的細胞質中。當受到各種因素刺激時，Akt被磷酸化并被PI3K激活[35]。活化Akt可促進細胞存活、增殖、轉移和血管生成。研究表明，Akt在許多人類腫瘤中被過度激活，如胃腸道腫瘤、胰腺癌和其他腫瘤組織。Akt在腫瘤細胞中的激活與腫瘤細胞的增殖和凋亡密切相關。Akt磷酸化可被特異性抑制劑哌立福新抑制[36-37]。因此，抑制信號通路已成為腫瘤治療的靶點之一。

哌立福新在研究PI3K/Akt信號通路在腫瘤中的作用，具有重要意義。在多種腫瘤中，哌立福新在體內外實驗中均顯示出顯著的增殖抑制活性，并準備進入Ⅲ期臨床試驗。研究表明，哌立福新和MEK/ERK抑制劑MEK-162或ABT-737 聯合治療能誘導肺癌細胞生長抑制和凋亡增加，體內實驗能明顯抑制肺癌的異種移植生長[38-39]。其在膀胱癌、肝癌、急性髓系白血病等腫瘤治療中也發揮著重要作用[40-42]。本課題組研究表明，在凋亡抵抗AGS細胞中，哌立福新可能有助于抑制生長和誘導較高的凋亡率。此外，Transwell和劃痕實驗一致顯示，哌立福新抑制了細胞的侵襲和遷移能力。凋亡抵抗細胞PIK3CA和Akt的mRNA表達降低，PTEN的表達增加。p-Akt、MMP-2和STAB1的蛋白表達隨哌立福新濃度的增加而減少，PTEN的表達增加。哌立福新通過PI3K/Akt途徑影響AGS細胞的侵襲和轉移，具有抗癌作用，是治療胃癌的一種潛在途徑。

基因敲除或異位過度表達策略已證實SATB1可影響細胞增殖、細胞周期、凋亡、細胞形態/細胞極性、EMT和多藥耐藥性，以及腫瘤的形成、生長、侵襲和轉移。研究發現，SATB1參與PI3K/Akt信號轉導通路的調節，可以與PI3KC亞型基因的MARs序列結合，從而抑制PI3KC的轉錄[43]。Akt蛋白激酶使SATB1在絲氨酸47上磷酸化并保護SATB1防止其凋亡裂解[44]。本課題組研究表明，下調SATB1能增強哌立福新介導的細胞生長抑制，促進凋亡抵抗AGS細胞的凋亡，使哌立福新抑制細胞侵襲及遷移的作用增強，表明SATB1在哌立福新對凋亡抵抗AGS細胞的抗腫瘤活性中起著關鍵作用。

綜上所述，哌立福新能不同程度地作用于凋亡抵抗AGS細胞，調節PI3K/Akt信號通路的關鍵信號分子，降低細胞增殖率，增加細胞凋亡率。哌立福新抑制細胞侵襲和遷移能力。然而，本研究的一個局限性是，僅使用AGS細胞株可能不能反映所有胃癌。使用其他細胞系的研究可能是必要的，以增加研究的概括性。