工業分枝桿菌植物甾醇轉化途徑及菌種改造研究進展

李 欣， 成細瑤， 彭 飛， 陳 甜， 黃永棋， 蘇正定

工業發酵教育部重點實驗室和湖北省工業微生物重點實驗室;湖北工業大學生物工程與食品學院，武漢 430068

甾類化合物在結構上是以環戊烷多氫菲為母核，包括三個六元環、一個五元環，和一系列不同的取代基組成。取代基的種類、構型與取代位點決定了不同甾類化合物的性質與功能[1]。自二十世紀九十年代以來，國際市場甾體類藥物的銷售額每年以10%-15%的速度遞增，2020年全球甾體類藥物銷售額預計將達到1 500億美元(http://www.chyxx.com/industry/202005/860576.html)。目前，甾體類藥物是僅次于抗生素的第二大類化學藥。甾體類藥物的高需求促進了甾體類藥物中間體的提取與制備的發展。在微生物轉化植物甾醇生產甾體藥物中間體的工藝技術成熟之前，以植物中薯蕷皂素作為低廉工業原料進行化學合成制備的工藝技術占據著主導地位。但隨著資源的限制和環保壓力，目前國際上甾體藥物的主要生產方式是以微生物轉化法合成起始原料，然后經過必要的化學修飾和藥性改造。與傳統化學法相比，微生物轉化法具有周期短、收率高、專一化強、立體選擇性和區域選擇性好以及污染小、條件溫和等優勢[2]。

對能夠降解甾醇的微生物的研究始于70多年前。后來，研究進一步發現屬于放線菌屬的微生物，如分枝桿菌、紅球菌，具有降解膽固醇的能力，并具有合成新類固醇衍生物的潛力[3]。此后，其他一些細菌，如諾卡氏菌屬、節桿菌屬、芽孢桿菌屬、短桿菌屬、棒狀桿菌屬、鏈霉菌屬、微桿菌屬、沙雷菌屬、無色桿菌屬、假單胞菌屬和魚精胺桿菌屬等，也被報道可部分或完全地降解膽固醇[4-9]。

甾醇代謝微生物的發現為甾體藥物的生產提供了新的思路。1952年，美國普強藥業利用黑根霉轉化孕酮，將原本復雜的化學合成簡化為3步且收率達到了90%[10]。隨后，人們又相繼發現某些菌株可以使甾體化合物在特定位點發生反應，例如新月彎孢霉可以對C11位進行羥基化[11]，亞麻刺盤孢(Colletotrichumlini)ST-1 還可以羥化黃體酮(EP)生成產物15α-OH-EP[12]。自此，微生物轉化在甾體藥物生產中的巨大應用潛力開始顯現出來(圖1)。

圖1 甾體化合物生物轉化位點及主要產物

目前，利用微生物開展甾體化合物轉化的主要反應有母核的羥化和脫氫以及側鏈的降解等。因為微生物自身含有豐富多樣的酶系，所以轉化反應并不總是以單一的形式發生。因此，利用一種微生物轉化多種反應是可能的。例如新月彎孢霉除了可以使甾體化合物發生11β-羥基化反應，將化合物S轉化為氫化可的松外，還可以使甾體化合物發生側鏈降解，將黃體酮轉化為雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)[13]。但是，甾體化合物最終會被微生物分解成二氧化碳和水，因此要對轉化反應進行適當的控制。隨著科技的發展，改造菌株的代謝途徑成為了可能。本文對工業分枝桿菌植物甾醇轉化途徑及菌種改造的研究進展進行了綜述。

1 甾醇代謝的分子機制

甾體化合物的降解是有氧代謝。早在20世紀八九十年代，研究人員就根據降解過程中產生的中間產物來研究可能的代謝途徑。VAN DER GEIZE R團隊發現了紅球菌和分枝桿菌降解甾醇的關鍵基因簇，并且闡釋了一些關鍵基因的功能[14-16]。目前，典型的分枝桿菌已經完成了全基因組測序[14, 17]。通過分析分枝桿菌基因的功能，已經初步闡明了甾醇降解反應的基本機制。甾醇降解的過程主要分為甾醇分子的攝取、母核的開環、開環甾醇的降解和側鏈的氧化四個步驟。

分枝桿菌中甾體的攝取與轉運影響著底物的利用水平。有研究者提出了一種靈活的多組分中間相模型(FMCM)來描述分枝桿菌對甾醇的吸收方式[18]。因為分枝桿菌的細胞外膜很厚，甾醇分子很難直接穿過。因此他們指出在分枝桿菌中應該有特定的蛋白質在甾醇的結合或轉運中起作用，從而促進甾醇分子的跨膜傳輸。其中，膽固醇氧化酶(ChO)是一種參與甾醇攝取的界面酶，促進了甾醇的轉運過程[18]。此外有研究表明，部分微生物的壁膜中含有能夠對甾醇分子轉運的蛋白Mce4(Mammalian cell entry 4)。例如在分枝桿菌、諾卡氏菌、紅球菌和部分鏈霉菌中均有發現存在Mce4攝取甾醇的機制[19]。

甾醇的初步氧化是在膽固醇氧化酶和3β-羥基脫氫酶(3β-HSD)兩個關鍵酶的作用下開啟的。MycobacteriumneoaurmATCC 25795有兩種ChO同工酶(ChoM1和ChoM2)。當缺失ChoM2時，菌株基本失去了氧化甾醇3β-羥基的能力[20]。但近年來，有研究小組提出在M.smegmatismc2155 和M. sp. VKM Ac-1815D等菌中普遍存在的ChoD不是甾醇氧化為甾酮的關鍵酶，因為ChoD失活的突變體菌株仍然保留了轉化甾醇為甾酮的能力[21, 22]。3β-Hsd反應時需要NAD或NADP作為輔酶，目前發現該酶在M.tuberculosis與M.smegmatismc2155兩種菌株中是氧化甾醇的關鍵酶[22, 23]。近期，我們在M.neoaurumHGMS2 菌種中發現，敲除ChoM1,ChoM2和HSD對膽固醇降解沒有明顯影響(數據發表中)。在放線菌中甾醇的側鏈降解和母核氧化是相對獨立的過程，甚至在同一種菌中這兩個過程的順序也是不同的[24,25]。甾醇母核氧化分為兩種，分別是羥化反應和脫氫反應。其中，以羥化反應為主。細胞色素P450依賴性單加氧酶是甾醇羥化反應的關鍵酶，以游離或者膜結合形式存在。這種酶可以在底物分子中增加一個氧原子，另一個氧原子則用于氧化還原型輔酶Ⅰ(NADH)或還原型輔酶Ⅱ(NADPH)，反應如下：RH + NADPH + O2→ ROH + NADP++ OH-[26]。3-甾酮-9α-羥化酶(KSH)也是參與母核氧化的關鍵酶。KSH由兩部分組成，分別為末端加氧酶KshA和鐵硫還原酶KshB。此外KSH還需要輔酶NADH與FAD參與反應。KSH的主要功能是催化甾體母核B環，在C9位引入羥基。3-甾酮-Δ1-脫氫酶(KstD)催化甾體分子母核A上1，2位的脫氫反應，與上述的KSH共同作用下，會引起母核B環的裂解。大多數KstD偏好4-烯-3-酮結構的底物，而KstDH37Rv最適底物是具有3-酮-(5α)-甾體結構[27]。研究者推測M.tuberculosis在降解甾體過程中與另一類3-甾酮-Δ4-(5α)-脫氫酶協同作用，經歷了5α-睪酮，5α-AD，1-(5α)-AD，ADD等中間代謝物后才解體[27]。

微生物對甾醇的側鏈降解反應是一類具有重要生理意義的反應，其地位僅次于甾醇的羥化。甾醇分子側鏈降解的過程類似于脂肪的β氧化，反應的復雜性由側鏈的長短決定。以膽固醇生成產物AD為例，過程中涉及了20多種酶的催化。研究發現，側鏈降解開始于以細胞色素P450加氧酶催化C26位的末端氧化，再經過?；鵆oA鏈接酶(FadD)催化末端?；髸M入微生物的脂肪酸β-氧化過程[28]。雖然在任何一種降解甾醇的細菌中，膽固醇的分解代謝還沒有完全闡明，但可以通過結合不同物種的生化和遺傳學研究來推測出較為完整的膽固醇代謝途徑[29]。

2 甾醇代謝途徑的基因改造

2.1 底物的攝取和轉運的強化

一般認為生物接觸是微生物攝取環境中的甾醇的主要方式。微生物中甾醇降解基因簇中的Mce4轉運系統對甾醇的主動攝取有影響。在R.jostiiRHA1中，當Mce4部分或整體缺失時，缺陷型菌株不再利用膽固醇、β-谷甾醇等底物來生長。但是，如果以AD或者黃體酮為底物時，Mce4缺陷型菌株的生長不受影響[14, 30]。

分枝桿菌含有一層非常厚且疏水的細胞包膜，其細胞壁結構也很復雜，由peptidoglycan (PG), arabinogalactan和mycolic acids組成(圖2)。因此，分枝桿菌的細胞外膜形成了一個屏障，阻止外源甾醇進入細胞，但其良好的疏水性可以溶解和存儲甾醇。WEI等[31]通過對kasB這一非必需基因進行了修飾。kasB基因的缺失降低了細胞壁的緊密性，從而使細胞通透性增加，增強了甾醇的轉運。對于另一種物質PG，在以往的研究中，萬古霉素和甘氨酸是在革蘭氏陽性菌生長過程中作用于PG生物合成的兩種有效抑制劑。經萬古霉素和甘氨酸處理后，增強了分枝桿菌轉化膽固醇的活性。這些研究表明，PG的合成可能成為分枝桿菌基因工程改造的一個潛在靶點，通過改變細胞壁的特性來提高分枝桿菌甾醇的轉化率。在分枝桿菌中，有兩種特征性的B類青霉素結合蛋白(PBPA和PBPB)，它們在調節PG的生物合成從而在促進細胞分裂和形狀維持方面發揮著重要的作用。SUN等[32]對pbpA和pbpB基因進行修飾，發現當兩者任意一個基因失活時，細胞轉化甾醇的能力降低。相反，增強pbpB基因的表達可以促進甾醇的轉化。還有研究報道表明，編碼海藻糖單肌酸轉運體基因mmpL3的失活，使M.neoaurum中植物甾醇的消耗量增加了15.6%[33]。

圖2 分枝桿菌細胞壁結構及膽固醇分解途徑

2.2 母核3-位羥基氧化反應

甾醇母核反應的第一步是由ChO和3β-HSD開啟的。ChOs在催化甾醇的過程中，通常結合到細胞膜表面，從細胞膜接觸底物[34]。與膽固醇、植物甾醇不同，膽固酮等這類甾體化合物不會結合在細胞膜中[35]。所以，甾醇經ChO氧化后，經從細胞膜上釋放出來，進入細胞質。這就意味著ChO的氧化過程可以促進分枝桿菌吸收環境中甾醇。因此，過表達產AD的分枝桿菌NwIB-R10中的ChO可以將AD的產量從1.08 g/L提高到了1.65 g/L[20]。當敲除M.neoaurmATCC 25 795中的ChOM1或者ChOM2，缺陷菌株的甾醇攝取與代謝速率都明顯降低。這表明甾醇氧化為甾酮是代謝途徑中關鍵的限速步驟，提高該步驟酶的活性可以增強甾醇吸收，進一步提高分枝桿菌的轉化率。

2.3 側鏈降解

來源于紅球菌的?；鵆oA連接酶FadD19能夠催化膽固醇與膽甾-4烯-3酮的C26末端羧基產物的酯化反應。WILBRINK[36]等人的研究表明，FadD19經敲除后發現，對微生物代謝膽固醇沒有影響，而β-谷甾醇的代謝明顯受到抑制，表明FadD19僅能催化C24位末端羧基產物的酯化反應。最后一輪β氧化中酶的反應效率會影響C19代謝產物的產量[15]，所以對側鏈降解的酶促反應研究也很重要。THOMAS等[37]敲除了基因簇中的igr操縱子，推測出催化最后一輪β氧化的脫氫、水合和硫解反應的酶，包括FadE2-29、Rv3541-42c、Ltp2。GRIFFIN等[38]采用高密度誘變和深度測序相結合的方法，對不同條件下復雜突變庫的組成進行了表征，發現分枝桿菌參與側鏈代謝的基因，包括ltp2、fadE29、fadE28、fadA5、fadE30、fadE32、fadE33、fadE34和hsd4B。除了將脂肪酸支鏈完全降解產生4-AD之外，目前還發現支鏈降解途徑有其他的分支，例如發現了產物HBC的積累。因此對甾醇支鏈降解機制的深入研究是非常必要的。

2.4 母核降解機制—9,10-甾體中間體途徑

除了ChO之外，KstD和KSH是母核代謝中另外兩種重要的酶。然而，當這兩種酶同時存在時，會導致甾體母核B環的裂解。以往的研究表明，加入抑制劑(如8-羥基喹啉)可以防止甾體母核的斷裂[39]，但抑制劑對側鏈降解的相關酶也會有一定的影響。另外，利用誘變技術產生突變體，也可以使甾醇不被完全降解。例如李瑩等[40]通過紫外誘變與激光誘變相結合的方式處理一株產AD的分枝桿菌，結果AD的收率提高了116%，且沒有ADD產生。BRZOSTEK等[41]確定KsdD-1是恥垢分枝桿菌的主要KsdD，在膽固醇降解過程中，KsdD-1的破壞導致AD或9-0H-AD的積累。WEI等[42]人對一株產AD和ADD混合物的M.neoaurumNwIB-01進行了基因改造。他們發現敲除KstD基因可以富集中間體AD；相反，強化KstD的表達則可以富集中間體ADD。從而，大大降低了后續產物分離純化的難度。

3 討論與展望

目前為止，通過對微生物代謝甾醇途徑的關鍵基因進行改造，已經實現了不同甾體藥物中間體的積累。但是所得到的中間體多是C19類化合物，C21以及C22類中間體的積累還需要更深入的研究。由于對甾醇側鏈降解所涉及的酶沒有全面的了解，目前甾醇的側鏈降解反應只能在微生物的全細胞內進行，還不能實現純酶催化。分枝桿菌細胞膜的結構復雜，盡管細胞膜缺陷的分枝桿菌細胞表現出更強的甾醇轉化活性，但由于細胞生長受損，整體生產力并沒有顯著的提高。因此，細胞壁性質與甾醇代謝能力之間的關系還需要進一步的研究[32]。ChO與甾醇攝取運輸機制的相關性一直是研究的主要內容之一。李園園等研究者[43]從分枝桿菌中鑒定相關的基因并敲除后，發現甾醇的代謝途徑并不受影響，或許有其他關鍵基因沒有并發現。因此，關于ChO在分枝桿菌攝取甾醇的過程中所起的作用仍然不是很清楚[20, 21]。雖然一些典型的分枝桿菌已經完成了全基因組測序，甾醇代謝的基本途徑已經被初步推斷出來，但參與甾醇代謝的相關酶系還需要更多的研究來進一步鑒定。近年來，甾體藥物的微生物發酵工藝已經不斷地改進，應用了很多對甾醇代謝微生物分子改造方面的成果。相信，隨著微生物代謝甾醇的機制及其功能簇基因不斷被揭示，微生物轉化法在甾體藥物的生產中將發揮越來越重要的作用。