黃芩苷對心肌缺血再灌注損傷的保護作用機制

劉萍，唐代，王旭，白云

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

心肌缺血再灌注損傷(I/R)致死率非常高，全球每年有超過600萬人死于I/R[1]。目前治療策略主要是通過經皮冠狀動脈介入治療(PCI)動脈放支架、采用溶栓或直接血管成形術恢復動脈血流。但是，除了直接的缺血性損傷，血流的復灌還會對心肌組織造成損傷，這種現象稱為再灌注損傷，其機制與心肌細胞的死亡有關[2]。再灌注損傷的發病機制涉及多種機制的相互作用，包括血管收縮劑的釋放、非再灌注、深度炎癥反應、細胞凋亡和壞死[3]。

在心臟再灌注過程中，會釋放多種細胞因子，導致心臟局部炎癥，進而導致組織損傷。許多研究表明，抑制過度炎癥可以減少梗死范圍，改善缺血再灌注損傷引起的心功能障礙[4]。與缺血再灌注損傷相關的是氧化/還原失衡導致活化氧和活化氮介導的信號通路的激活。氧化應激被認為是早期心肌缺血再灌注損傷的病理變化[5-6]。

心肌梗死導致心臟組織缺血性壞死，這是死亡的主要原因。梗死后，促炎性免疫細胞，尤其是多形核白細胞/單核細胞，被迅速募集到心臟。浸潤性中性粒細胞和巨噬細胞被激活，從而引發炎癥、氧化應激和細胞外基質成分沉積[7]。

眾所周知，激活NF-κB和MAPK可導致心肌缺血。NF -κB和MAPK通路已被證明參與許多生理功能，包括高血壓、心力衰竭和心肌肥大等。許多研究表明抑制MAPK信號與激活核因子-紅細胞2相關因子2 (Nrf-2)能顯著緩解心臟損傷，Nrf-2同時可以調控血紅素加氧酶1(HO-1)。許多研究表明HO-1心肌缺血再灌注中起到至關重要的作用[8-9]。

心血管疾病是全世界的主要死亡原因，不僅影響高收入國家，也影響低收入和中等收入國家。冠心病和缺血性心肌病是最重要的心血管疾病類型。隨著心血管疾病的治療，現代醫學有了顯著的進步。抗心絞痛藥物等是心血管疾病的一線治療藥物。與此同時，一些中藥因其顯著的臨床療效而逐漸進入公眾視野。黃芩是亞洲地區常用的中草藥之一，臨床應用歷史悠久，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效。黃芩苷，又稱7-葡萄糖醛酸-5，6-二羥基黃酮，是從黃芩(唇形科)中分離得到的一種黃酮類化合物，在中藥中被廣泛用作治療各種炎癥性疾病。以往的研究表明，黃芩苷具有廣泛而有效的生物活性，包括抗炎、抗病毒和抗腫瘤作用。然而，關于黃芩苷治療I/R的報道雖有一些，但是報道比較淺顯。因此本文重點研究黃芩苷對心肌缺血再灌注的保護作用。

1 材料與方法

1.1 試劑

黃芩苷(純度：97%)由上海源葉生物有限公司提供。白細胞介素-1β(IL-β)、白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯免疫試劑盒購自Elabscience。心肌酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)購自南京建成生物工程有限公司。所有抗體購自于美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 動物

雄性SD大鼠(8周齡，200～220 g)由黑龍江中醫藥大學動物中心提供，并且飼養在黑龍江中醫藥大學動物中心SPF級動物房，濕度：55%～70%，溫度：23～25 ℃。所有SD大鼠自由飲水飲食。所有動物操作嚴格按照黑龍江中醫藥大學動物倫理指南操作。

1.3 實驗動物分組、給藥及處理

SD大鼠分組如下(n=10):假手術(Sham)組、缺血再灌注(I/R)組、I/R+地爾硫卓組(Dil)、I/R+BA(20、40、80 mg/kg) 組。假手術組大鼠不進行接扎，灌注正常進行。假手術組和I/R組大鼠給予生理鹽水2周。Dil和BA治療組大鼠分別給予Dil(20 mg/kg,灌胃)和BA(20、40、80 mg/kg，灌胃)4周，隨后進行缺血再灌注。按照之前報道[10]手術過程如下:大鼠按照體質量，腹腔注射氨基甲酸乙酯(0.5 mL/100 mg)麻醉大鼠。隨后，大鼠以仰臥位固定在手術臺上，將大鼠小心鏈接到四導心電圖上，手術過程中檢測手術過程中的變化，并同時監測心電圖以排除異常的大鼠。小心地分離大鼠的氣管，并小心切開后立即用與呼吸機進行機械通氣(呼吸頻率60次/min，潮氣量8 mL，頻率5∶4)。氣管內插管后，小心分離大鼠頸總動脈并插入導管，同時將壓力傳感器連接到生物信息收集系統。仔細去除SD大鼠的胸毛，然后用碘伏仔細消毒皮膚。打開左胸暴露心臟，剝去心包找到冠狀動脈，穿過離左心耳2 mm的小乙烯管，使結扎線(4/min線)形成一個環來結扎冠狀動脈。左前降支結扎30 min，隨后，再灌注120 min。假手術組流程一樣，只是不接扎。心肌缺血再灌注手術完成后，實驗者小心地將大鼠的肌肉和皮膚逐層縫合，并在切口處注射少量青霉素或擦拭碘伏以消毒傷口，防止傷口感染。

1.4 缺氧-復氧(H/R)實驗方案

取對數生長期生長的H9C2細胞，棄去原來的培養液，加入含有95% N2和5% CO2混合氣體液培養，連續培養6 h，模擬缺氧。隨后加入含有有95% O2和5% CO2混合氣體的培養液復氧。

1.5 細胞活力測定

H9C2心肌細胞接種在96孔板1×105/孔。在H/R方案進行之前，細胞給予不同濃度的BA (1、2、4、8和16 μL)下孵育12 h，然后根據上述細胞活力進行評估。根據CCK-8檢測試劑盒說明，加入10 μL的CCK8溶液并在450 nm波長處讀取吸光度。

1.6 心電圖測量

SD大鼠按體質量給予氨基甲酸乙酯(0.5 mL/100 mg)，然后將大鼠固定在實驗板上的背部位置，用皮膚覆蓋頸部和胸部，然后用碘伏消毒，鋪無菌孔巾，將針狀心電圖電極插入大鼠四肢皮膚下，連接心電圖儀，監測并記錄心電圖變化。

1.7 血清與細胞上清細胞因子檢測

根據ELISA制造商的說明書方法測定血清、和細胞上清液中IL-6、IL-β和TNF-α的含量。

1.8 心肌酶檢測

根據試劑盒說明書，并且嚴格按照說明書流程，檢測血清CK和LDH水平。

1.9 血清和細胞上清液中SOD、MDA測定

根據試劑盒說明書，并且嚴格按照說明書流程，檢測血清和細胞上清液中SOD、MDA。

1.10 心肌組織學檢查

將4%多聚甲醛固定的心臟組織包埋于石蠟，制備4 μm切片，按常規HE染色程序操作。在光學顯微鏡下觀察心臟病理學改變。

1.11 蛋白質印跡

用RIPA裂解液提取心臟組織和H9C2細胞的總蛋白，并收集12 000 rpm離心20 min。BCA試劑盒用于定量蛋白含量。各組蛋白樣品用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。然后將PVDF膜置于5%脫脂奶粉封閉2 h。隨后將PVDF膜置于相應的一抗(p-JNK、JNK、p-ERK、ERK、p-P38、P38、HO-1、Nrf-2、p-P65、P65、Caspase-3、Caspase-9、Bax和Bcl-2)中，在4 ℃孵育過夜。第二天用TBST洗4次，每次8 min。然后將聚偏氟乙烯膜置于二抗，并在室溫下于搖床中培養2 h。取下聚偏氟乙烯膜，用TBST水洗4次，每次8 min。凝膠成像系統用于曝光和掃描條帶，以分析每個條帶的灰度值。

1.12 統計分析

2 結果

2.1 BA對心肌組織病理學的影響

如圖1所示，假手術組大鼠心臟結構完整，正常的肌原纖維結構伴有條紋，分支外觀和與相鄰肌原纖維的連續性。心臟結扎手術后的心臟出現大量浸潤性炎癥細胞、心肌細胞腫脹、變性、心臟壞死和橫紋消失。BA (20、40、80 mg/kg)與Dil(20 mg/kg)顯著改善了上述病理變化。

圖1 BA對心肌組織病理學的影響(×200)

2.2 BA對H9C2細胞活力的影響

如圖2所示，將細胞暴露于缺氧6 h，然后再給氧24 h后24 h通過CCK8分析檢測細胞活力。缺氧6 h導致細胞活力顯著下降，而BA增加了H9C2細胞的活力。

注：與正常組比較,##P<0.01;與H/R比較,**P<0.01。圖2 BA對H9C2細胞活力的影響

2.3 BA對心電圖ST段的影響

如圖3所示，與假手術組相比，缺血再灌注組的ST段明顯升高，結果表明，BA(20、40、80 mg/kg)與Dil(20 mg/kg)顯著降低ST段。

圖3 BA對心電圖ST段的影響

2.4 BA對血清、細胞上清液中炎性細胞因子的影響

如表1與表2所示，缺血再灌注組血清與缺氧/復氧組細胞上清液中IL-6、IL-β和TNF-α水平明顯升高。BA或Dil顯著降低血清、細胞上清液中IL-6、IL-β和TNF-α的水平。

表1 BA對血清中炎性細胞因子的影響

表2 BA對細胞上清炎性細胞因子的影響

2.5 BA對心臟標志酶的影響

如表3所示，與假手術組大鼠相比，I/R組大鼠的CK和LDH水平明顯升高。與I/R組相比，MAF和Dil顯著降低CK和LDH水平。

表3 BA對心臟標志酶的影響

2.6 BA對血清SOD、MDA的影響

如表4所示，與假手術組比較，I/R組大鼠血清SOD顯著降低、MDA顯著升高，BA與Dil顯著降低MDA、升高SOD。

表4 BA對血清SOD、MDA的影響

2.7 BA對缺血再灌注大鼠心臟MAPK/Nrf-2/HO-1/NF-κB通路的影響

如圖4所示，與假手術組大鼠比較，I/R組大鼠心臟組織中p-JNK、p-ERK、p-P38和p-P65的水平顯著升高，Nrf-2和HO-1的水平顯著降低。BA與Dil能顯著恢復上述改變。

圖4 BA對缺血再灌注大鼠心臟MAPK/Nrf-2/HO-1/NF-κB通路的影響

2.8 BA對H/R誘導H9C2細胞MAPK/Nrf-2/HO-1/NF-κB通路的影響

如圖5所示，與正常組細胞比較，H/R組H9C2細胞中p-JNK、p-ERK、p-P38和p-P65的水平顯著升高，Nrf-2和HO-1的水平顯著降低。BA能顯著恢復上述改變。

圖5 BA對H/R誘導H9C2細胞MAPK/Nrf-2/HO-1/NF-κB通路的影響

3 討論

目前，對心血管疾病的干預有很多，如對冠心病的溶栓和冠狀動脈搭橋術。盡管死亡率顯著下降，但與這些治療相關的缺血再灌注損傷使結果不太令人滿意。因此，在研究中，需要預防和治療缺血再灌注心臟疾病。在本實驗中，BA顯著改善了I/R組大鼠ST抬高，減少了CK-MB和LDH水平，改善了心肌病理變化，并恢復了炎癥和氧化應激相關的通路。

目前治療心肌缺血的藥物有幾種:一是鈣通道阻滯劑，如硝苯地平、地爾硫卓等;第二，抗氧化劑自由基發生劑，如維生素C等;第三類是能量混合物磷酸肌酸;第四，抗白細胞聚集，如烏司他丁。其中，第一類鈣離子阻滯劑是治療心肌缺血最常用的藥物，也是治療心肌缺血應用最廣泛的藥物。其他研究者也報道了地爾硫卓對心肌缺血再灌注損傷的治療作用[11-13]，這是我們在本實驗中選擇地爾硫卓作為陽性藥物的基礎。

據報道，MAPK通路是細胞存活和凋亡所必需的信號通路[15-17]。在這方面，我們假設BA對心肌缺血再灌注的保護作用與MAPK信號通路有關。正如預期的那樣，本研究結果顯示BA顯著降低了I/R大鼠和H/R的H9C2細胞中ERK 1/2、JNK和p38磷酸化的水平。作為MAPK的下游分子，NF-κB在心肌缺血炎癥和凋亡進程的調節中起著重要作用[18-19]。NF-κB的激活是由IκBα的磷酸化和降解誘導的[20]。NF-κB調節炎癥細胞因子的產生、氧化應激和凋亡反應[21]。有證據表明MAPK/NF-κB通路參與體內和體外心肌缺血再灌注損傷[22]。本實驗結果證實，與假手術組比較，在I/R模型中p-JNK、p-ERK、p-P38和p-P65的水平顯著增加。與I/R相比，BA與Dil顯著降低p-JNK、p-ERK、p-P38和p-P65水平。H9C2細胞在H/R刺激后，p-JNK、p-ERK、p-P38和p-P65水顯著升高，BA顯著降低p-JNK、p-ERK、p-P38和p-P65水平。

I/R可引起細胞因子如IL-6、IL-β和TNF-α。TNF-α主要由巨噬細胞分泌，巨噬細胞可通過增加其他促炎細胞因子的釋放和影響中性粒細胞募集來促進炎癥級聯反應。IL-6作為炎癥中的一種重要細胞因子，在缺血再灌注引起的炎癥中起著重要作用。IL-β可以誘導其他炎癥介質的釋放，增加細胞粘附因子的表達，促進中性粒細胞與內皮細胞的粘附。實驗結果表明，BA和Dil顯著降低了大鼠血清IL-6、IL-β和TNF-α的水平。H/R刺激H9C2細胞后，血清IL-6、IL-β和TNF-α的水平顯著升高，BA能降低細胞上清IL-6、IL-β和TNF-α的水平。

研究表明，抑制MAPK激活可以激活Nrf-2，然后上調HO-1[23]。活化的Nfr-2從Keap 1(Nrf-2的抑制劑)中釋放出來，并轉移到細胞核，在細胞核中與抗氧化反應元件(ARES)結合，加速HO-1的表達。據報道，HO-1是第二階段抗氧化酶之一，在I/R中起關鍵作用[24]。本結果證實，與假手術組相比，I/R組大鼠的Nrf-2、HO-1和SOD水平顯著降低，MDA水平顯著升高。與I/R組相比，BA和Dil能提高Nrf-2、HO-1和SOD水平，降低MDA的水平。H/R刺激后H9C2細胞后細胞Nrf-2、HO-1和SOD水平顯著降低、MDA顯著升高，BA能顯著逆轉上述改變。

綜上所述，BA對I/R有顯著的保護作用，其機制與調控MAPK/Nrf-2/HO-1/NF-κB信號介導的氧化應激與炎癥相關。