TRIM28siRNA抑制非小細(xì)胞肺癌A549裸鼠移植瘤生長以及促進凋亡的研究*

張子平,閆皓翔,李霄雨,宋芳,戎子炎,高淑超,褚升瑞,魏澤浩,許倩,劉鐳

承德醫(yī)學(xué)院 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2017級臨床醫(yī)學(xué)本科班；2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2016級臨床醫(yī)學(xué)本科班；3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2018級麻醉本科班；4基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2018級臨床醫(yī)學(xué)本科班；5基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所；6基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室(河北承德 067000)

肺癌是全世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤疾病，其中80%以上屬于非小細(xì)胞肺癌 (non-small cell lung cancer,NSCLC)[1]，5年存活率平均為15%。NSCLC往往早期就會侵犯血管，易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，這些不適合手術(shù)切除的NSCLC患者，即使經(jīng)過化療后，患者的5年生存率也僅為5%[2]。而且，目前臨床治療藥物均具有明顯的毒不良反應(yīng)，因此探索肺癌的發(fā)病機制，尋找新的高效的治療靶點是國內(nèi)外研究的熱點之一。課題組前期研究表明[3]，TRIM28基因在NSCLC細(xì)胞系和組織中均高表達。TRIM28能夠促進肺癌細(xì)胞的生長，敲低NSCLC細(xì)胞株中TRIM28基因的表達，顯著降低了細(xì)胞的增殖并抑制了細(xì)胞周期的進展。大量研究證實，TRIM28是三基序超家族的重要成員，具有調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、染色質(zhì)組織、紅細(xì)胞分化和DNA損傷反應(yīng)等重要功能[4-6]。同時，TRIM28也是一種廣泛的KRAB鋅指蛋白共抑制因子。研究表明，TRIM28還在多種腫瘤的癌變和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用，如宮頸癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、卡波西肉瘤和卵巢癌[7-10]。下調(diào)TRIM28基因表達可降低腫瘤干細(xì)胞的自我更新能力，明顯抑制腫瘤生長。短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)介導(dǎo)的TRIM28缺失可導(dǎo)致E-cadherin和N-cadherin啟動子上組蛋白的乙酰化和甲基化，進而阻斷了轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)誘導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。TRIM28功能缺失能夠?qū)е录?xì)胞周期、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)性、癌細(xì)胞代謝的失調(diào)，并抑制氧化磷酸化的發(fā)生[11]。盡管TRIM28的這些生物學(xué)功能是眾所周知的，但人們對TRIM28在NSCLC中的作用機制卻知之甚少。2018年10月至2020年1月，我們用NSCLC細(xì)胞A549建立了裸鼠皮下移植瘤模型，并進一步觀察TRIM28基因敲除在NSCLC裸鼠移植瘤模型中具有抗腫瘤和促凋亡活性，以期為NSCLC有效治療策略的制定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549為本實驗室保存。Balb/c裸鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清均購自GIBICO公司(美國)。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR master mix購自TaKaRa公司(日本)；抗綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)單克隆抗體、兔抗人Ki-67、Bax、Bcl-2、Caspase3、β-actin 單克隆抗體，及辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)標(biāo)記二抗均為Abcam 公司(美國)產(chǎn)品；脫氧尿苷三磷酸缺口末端標(biāo)記(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling,TUNEL)試劑盒購自碧云天生物試劑公司(中國)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞采用RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)于CO2培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2)靜置培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長狀態(tài)良好并且融合度達到80%左右時，用2.5 g/L的胰蛋白酶消化進行細(xì)胞傳代。

1.3 裸鼠皮下移植瘤模型的建立和鑒定 取Balb/c雌性裸鼠6只，4只為實驗組，2只為對照組。1×107個A549細(xì)胞溶解于0.2 mL培養(yǎng)基中制成細(xì)胞懸液，每只實驗組裸鼠右側(cè)股背處皮下注射。對照組裸鼠于相同部位注射0.2 mL培養(yǎng)基。每天觀察裸鼠的一般狀況，間日測量裸鼠體重，并測量皮下腫瘤的長徑a和短徑b，根據(jù)公式V=1/2(ab2)計算腫瘤體積。待腫瘤體積達到0.5 cm3時，視為造模成功。裸鼠于皮下注射4周，麻醉后摘眼球處死，取皮下腫瘤組織在10%甲醛溶液中固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋，切片4 μm，行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色。本實驗在承德醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)和監(jiān)督下進行。

1.4 TRIM28穩(wěn)定干擾A549細(xì)胞株建立 針對TRIM28 的小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)由上海吉瑪生物公司合成，TRIM28siRNA靶向序列為：5′-CACTGAGGACTACAACCTT-3′；5′-GCGATCTGGTTATGTGCAA-3′。將0.5 μg pLVTHM/TRIM28 siRNA表達載體(或?qū)φ蛰d體)和1.5 μg混合包裝載體質(zhì)粒混勻于250 μL OPTIMEM無血清培養(yǎng)基中，10 μL Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，24 h后更換成RPMI1640完全培養(yǎng)液。72 h后收集細(xì)胞上清液，0.45 μm濾膜過濾分裝即為病毒液，-70℃ 保存?zhèn)溆谩２《疽焊腥続549細(xì)胞后，應(yīng)用抗GFP單克隆抗體和流式細(xì)胞術(shù)篩選陽性克隆細(xì)胞。

1.5 TRIM28 siRNA抑制裸鼠成瘤實驗 10只裸鼠隨機分為2組，每組5只。第1組皮下注射A549/TRIM28siRNA細(xì)胞(TRIM28siRNA組)，第2組皮下注射A549/ControlsiRNA細(xì)胞(ControlsiRNA組)。每天觀察小鼠的生存狀況，隔天測量1次小鼠體重和腫瘤大小。注射4周后麻醉處死動物，切除腫瘤并稱量腫瘤重量。

1.6 移植瘤組織學(xué)檢測 皮下腫瘤組織在10%甲醛溶液中固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋，切片4 μm，行HE染色。采用鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(strept avidin-biotin complex,SABC)免疫組化法檢測Ki-67的表達，1∶1 000稀釋度的兔抗人Ki-67單克隆抗體作為一抗，生物素化羊抗兔IgG作為二抗，稀釋度1∶2 000，Image Pro Plus軟件進行定量分析。

1.7 TUNEL測定法 將小鼠移植瘤石蠟切片脫蠟、水合，PBS漂洗后用枸櫞酸鈉和Triton X-100處理，按TUNEL試劑盒操作步驟，配置反應(yīng)混合液，并加入到樣品上，避光放置2 h后，熒光顯微鏡下觀察，每張片上隨機選取5個視野，按如下公式計算凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)：AI=具有凋亡核的細(xì)胞數(shù)/計數(shù)的細(xì)胞總數(shù)×100。

1.8 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)方法 按Trizol說明書進行操作，首先抽提細(xì)胞總RNA，取500 ng RNA進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以cDNA為模板，0.2 μmol/L上下游引物，并加入SYBR Green PCR master mix配制20 μL PCR反應(yīng)體系，引物序列如下：Bal-2：上游5′-AGGGGGAAACACCAGAAT-3′；下游5′-GGTAGCGACGAGAGAAGTCA-3′，Bax：上游5′-CCAGGATGCGTCCACCAA-3′；下游5′-CAAAGTAGAAGAGGGCAACCAC-3′，Caspase3：上游5′-GGCGTGAAGACATTTTGGAA-3′；下游5′-CGGGAGTAGTCGCCTCTGAA-3′。擴增條件為94℃ 10 min,94℃ 15 s,60℃ 25 s，72℃ 35 s，共40個循環(huán)。GAPDH 作為內(nèi)參，每樣本設(shè)3個復(fù)孔。按下列公式計算各組目的基因的相對表達量(Q)。ΔCt目的基因=Ct目的基因-CtGAPDH；ΔΔCt=ΔCt實驗組-△Ct對照組；Q=2-ΔΔCt。

1.9 Western blot檢測 兩組移植瘤加裂解液后勻漿，取上清液，BCA法測蛋白濃度。等量蛋白首先經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，再轉(zhuǎn)移到PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加兔抗人Bal-2、Bax或Caspase3單克隆抗體(1∶1 000)孵育4℃過夜，經(jīng)TBST洗滌后，加HRP標(biāo)記的二抗(1∶2 000)，室溫孵育2 h，TBST洗滌后，ECL發(fā)光液顯色曝光，并在Quantity One分析軟件上測定條帶灰度值，計算蛋白相對含量。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功建立NSCLC A549細(xì)胞裸鼠移植瘤模型 A549細(xì)胞懸液接種于裸鼠股背處，5～7 d肉眼可見移植瘤形成，平均潛伏期為(5.00±1.15)d。4周后，移植瘤體積達到(1.93±0.15) cm3，腫瘤體積生長情況見圖1-A。4只實驗組裸鼠全部成瘤，成瘤率為100%；2只對照組裸鼠無成瘤。實驗組裸鼠體重增長減緩，與對照組裸鼠比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-9.275，P=0.001)，見圖1-B。裸鼠麻醉后處死，解剖取移植瘤，經(jīng)HE染色，光鏡下觀察可見大量增生細(xì)胞，細(xì)胞異型性明顯，形態(tài)、大小不一，細(xì)胞核體積增大，著色加深，伴出血壞死，可見紅細(xì)胞，見圖1-C。

注：A：4只實驗裸鼠移植瘤體積生長曲線；B：實驗組和對照組裸鼠體重變化；C：裸鼠移植瘤HE染色。*P<0.05

2.2 TRIM28基因敲除抑制裸鼠移植瘤的生長 兩組裸鼠分別皮下注射A549/TRIM28siRNA細(xì)胞和A549/controlsiRNA細(xì)胞。4周后麻醉處死裸鼠，觀察移植瘤生長情況，發(fā)現(xiàn)TRIM28siRNA組裸鼠移植瘤比ControlsiRNA組腫瘤更小(圖2-A)。注射A549/controlsiRNA細(xì)胞的裸鼠在1周內(nèi)出現(xiàn)腫瘤，而注射A549/TRIM28siRNA細(xì)胞的裸鼠均在1周以后形成腫瘤(圖2-B)。4周后TRIM28siRNA組和ControlsiRNA組裸鼠移植瘤體積分別為(1.13±0.08)cm3和(1.82±0.28)cm3，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-5.432，P=0.001)(圖2-B)。另外，與ControlsiRNA組[(0.98±0.08)g]相比，A549細(xì)胞中沉默TRIM28后可顯著降低移植瘤重量[(0.41±0.08)g；t=-11.489，P<0.001；圖2-C]。實驗期間，TRIM28siRNA組裸鼠體重[(22.20±0.70)g]明顯高于ControlsiRNA組[(20.48±0.52)g；t=-4.500，P=0.002；圖2-D]。

注：A：TRIM28siRNA組和ControlsiRNA組裸鼠移植瘤圖像；B：兩組裸鼠移植瘤體積變化；C：兩組移植瘤重量比較；D：兩組裸鼠體重變化。*與ControlsiRNA組比較P<0.05

2.3 TRIM28siRNA誘導(dǎo)裸鼠移植瘤細(xì)胞凋亡 腫瘤組織的HE染色顯示，注射A549/ControlsiRNA細(xì)胞的裸鼠移植瘤組織中富含充滿紅細(xì)胞的微血管(圖3-A右)；但是，在注射A549/TRIM28siRNA細(xì)胞的裸鼠移植瘤中很少觀察到微血管(圖3-A左)。Ki-67染色檢測細(xì)胞增殖情況，結(jié)果可見，TRIM28siRNA組裸鼠移植瘤組織中Ki-67的表達水平[(21±4.36)%]明顯少于ControlsiRNA組[(52±10.15)%；t=-4.861，P=0.008]；見圖3-B和3-C。TUNEL法檢測裸鼠移植瘤細(xì)胞凋亡情況，與對照組相比，TRIM28基因敲除顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(圖3-D)。注射A549/TRIM28siRNA和A549/controlsiRNA細(xì)胞的裸鼠移植瘤組織中，TUNEL陽性細(xì)胞的百分率分別為(58.67±7.77)%和(15.00±3.00)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-9.083，P=0.001)；見圖3-E。

2.4 TRIM28基因敲除對Bcl-2、Bax和Caspase3表達水平的影響 采用實時熒光定量PCR和western-blot法檢測抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax、Caspase3的表達水平。與ControlsiRNA組相比，注射A549/TRIM28siRNA細(xì)胞的裸鼠移植瘤組織中Bcl-2的mRNA和蛋白質(zhì)水平明顯下調(diào)(圖4-A、D和E)；而Bax(圖4-B、D和E)和Caspase3(圖4-C、D和E)的mRNA和蛋白表達水平明顯上調(diào)，見表1。

表1 TRIM28基因敲除對Bcl-2、Bax和caspase3表達水平影響的統(tǒng)計學(xué)結(jié)果

3 討論

裸鼠是重要的腫瘤研究實驗動物模型，可用于腫瘤分子機制，抗腫瘤藥物的開發(fā)及藥物敏感度等研究[12]。由于皮下移植瘤模型具有成瘤率高、易操作、腫瘤體積易測量等優(yōu)點，因此成為最常用的造模方式[13]。本研究中，我們應(yīng)用NSCLC A549細(xì)胞系建立了裸鼠皮下移植瘤模型，成瘤率高達100%。

通過組織學(xué)鑒定，移植瘤組織HE染色鏡下觀察發(fā)現(xiàn)大量增生的腫瘤細(xì)胞，提示裸鼠移植瘤模型符合腫瘤的特性。本研究能夠成功建立裸鼠A549細(xì)胞移植瘤模型，我們認(rèn)為是在造模的過程中注意了以下幾個方面的因素：第一，本研究選取的是5～6周齡的裸鼠。這個周齡的小鼠既能夠耐受腫瘤細(xì)胞，同時免疫系統(tǒng)功能又基本完全缺失，大大提高了成瘤率。第二，注射時的A549細(xì)胞要在對數(shù)生長期且存活率>90%，并且細(xì)胞懸液須在制備后1 h內(nèi)完成注射。第三，我們使用的是4.5號的一次性注射器針頭，既可防止細(xì)胞懸液外漏又保證了細(xì)胞在通過針頭時不遭到擠壓而被破壞。另外，我們還注意了裸鼠的飼養(yǎng)環(huán)境，以及及時更換墊料、籠具等因素。

TRIM28是多種腫瘤發(fā)生的重要調(diào)控因子。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)TRIM28在乳腺癌中過表達，乳腺癌細(xì)胞系中TRIM28的缺失可減緩細(xì)胞增殖，抑制小鼠移植瘤的生長和轉(zhuǎn)移[8]。Bojkowska等[14]證明，肝臟中特異性TRIM28基因敲除可導(dǎo)致顯著的兩性表型紊亂，并發(fā)展為男性特異性脂肪變性和繼發(fā)性肝腫瘤。TRIM28基因在胃癌組織中的表達明顯增高，在胃癌細(xì)胞株中敲除TRIM28后，癌細(xì)胞的增殖率和抗凋亡能力下降。本研究中，我們也發(fā)現(xiàn)TRIM28基因敲除，能夠顯著抑制NSCLC裸鼠腫瘤的生長。以上這些研究都說明，TRIM28能夠促進各種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。因此，TRIM28基因的敲除有可能成為多種腫瘤治療的靶點。另外，在研究中我們還發(fā)現(xiàn)，組織切片的HE染色顯示TRIM28基因敲除組的血管生成減少，提示TRIM28可能在抗血管生成中發(fā)揮作用，這也可能是抑制腫瘤形成的一種機制。但其潛在的機制還需要我們通過進一步的研究來闡明。

研究中發(fā)現(xiàn)，TRIM28基因敲除能夠顯著誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡(P<0.001)。此外，TRIM28基因敲除在基因和蛋白水平上都增加了Bax和Caspase3的表達，同時降低了Bcl-2的表達。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)TRIM28與MDM2可相互作用，從而刺激p53-HDAC1復(fù)合物的形成。此外，TRIM28基因的敲除促進了p53的乙酰化和轉(zhuǎn)錄活性，增強了p53對DNA損傷的反應(yīng)，增加了細(xì)胞凋亡[15]。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，TRIM28在不依賴視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白的情況下，通過與E2F1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的方式調(diào)節(jié)E2F1信號途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，我們前期研究也發(fā)現(xiàn)，TRIM28能夠抑制E2F1活性[16]。有人還發(fā)現(xiàn)，與內(nèi)源性STAT1相關(guān)的TRIM28抑制了干擾素介導(dǎo)的信號途徑。小干擾RNA技術(shù)介導(dǎo)TRIM28表達下調(diào)后，可增強干擾素誘導(dǎo)的STAT1依賴性IRF-1基因表達。內(nèi)源性TRIM28與體內(nèi)內(nèi)源性STAT3也相關(guān)，沉默TRIM28表達可增強白細(xì)胞介素-6誘導(dǎo)的STAT3依賴性轉(zhuǎn)錄和基因表達，并顯著增加Ser727核上磷酸化的STAT3。上述這些研究都表明，TRIM28可能在許多凋亡信號通路中發(fā)揮作用，但其具體的作用機制仍不完全清楚。

注：熒光定量PCR法檢測兩組移植瘤組織中Bcl-2mRNA(A)、BaxmRNA(B)、Caspase3mRNA(C)的表達水平。D、E：Western-blot 法檢測兩組移植瘤組織中Bcl-2、Bax和Caspase3的蛋白表達水平。*與ControlsiRNA組比較P<0.05

本研究中，我們建立了NSCLC裸鼠皮下移植瘤模型，并利用該模型證明siRNA慢病毒載體沉默TRIM28的表達，可抑制NSCLC移植瘤的生長。但如果需要進一步探討TRIM28的作用，特別是對轉(zhuǎn)移的影響，就需要建立一個臨床相關(guān)的肺癌原位模型。將人肺癌細(xì)胞株進行基因轉(zhuǎn)化，表達熒光蛋白。首先建立裸鼠皮下移植瘤，取移植瘤并切碎，在裸鼠肺上進行外科原位移植。熒光成像檢測腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。雖然，本研究只在裸鼠皮下進行了移植瘤實驗，并初步證明了TRIM28在體內(nèi)的功能，但也為進一步研究肺癌的發(fā)病機制，以及發(fā)現(xiàn)新的治療靶點打下了基礎(chǔ)。