靶向CysC基因shRNA慢病毒載體的構建對NSCLC A549細胞增殖的影響及機制初探*

鄭大煒，郭娜

南陽市中心醫院呼吸科(河南南陽 473009)

肺癌是全球發病率和病死率排名靠前的惡性腫瘤之一，我國更是肺癌患病大國，2014年全國腫瘤登記中心的數據顯示我國肺癌發病率為35.23/10萬，在全部惡性腫瘤發病中占19.59%；病死率為27.93/10萬，在全部惡性腫瘤發病中占24.87%[1-2]。而非小細胞肺癌(non-small cell lung cance,NSCLC)在所有肺癌患者中高達85%，5年生存率低至15%[3]。究其原因發現，術后腫瘤復發和轉移是影響NSCLC患者預后的重要原因[4]。研究顯示，手術聯合化療在一定程度上可延長患者的生存時間，但也易對患者造成一定損傷影響其生活質量[5]。因此明確肺癌發病機制，尋找新的NSCLC治療靶點和藥物，為患者提供更好的診療手段，延長患者生命，提高生活質量，是目前甚至將來最主要的任務之一。半胱氨酸蛋白酶抑制劑C (Cystatin C,Cys C)是一種屬于Cys Ⅱ家族的分泌型蛋白，又稱CST3，可抑制包括半胱氨酸蛋白酶在內的多種蛋白水解酶活性，在炎性反應及腎癌、卵巢癌、結直腸癌等惡性腫瘤發生、發展中有一定影響[6-7]。但目前在NSCLC中的研究報道較少。2017年5月至2018年12月，本研究通過構建CysC-shRNA慢病毒載體，探討CysC對NSCLC細胞增殖的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 NSCLC A549細胞、TOP10大腸桿菌感受態細胞和293T細胞購自中國科學生命院上海細胞研究所；RPMI-1640培養基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶和青霉素-鏈霉素溶液均購自美國Gibco公司；T4連接酶、限制性內切酶Age Ⅰ和EcoR Ⅰ及連接試劑盒均購自美國NEB公司；慢病毒載體Pglv2-U6-Puro及包裝質粒購自上海吉瑪基因化學有限公司；質粒提取試劑盒、RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒及轉染試劑盒Lipofectamine購自美國Invitrongen公司；qRT-PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；MTT購自美國Sigma公司；細胞總蛋白提取和二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)試劑盒蛋白定量試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；兔抗人β-actin、PI3K和Akt單克隆抗體購自美國Abcam公司；二抗購自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和分組 將A549細胞和TOP10大腸桿菌感受態細胞接種于RPMI-1640培養基，置于37℃、5% CO2培養箱中，當細胞密度達到80%～90%時用胰酶進行消化傳代。本研究共分為3組：CysC-shRNA組、Ctr-shRNA組和空白對照組，前者須將CysC-shRNA重組慢病毒轉染A549細胞，中間須將Ctr-shRNA重組慢病毒轉染A549細胞，后者無須任何處理。

1.2.2 構建CysC-shRNA重組慢病毒 根據GenBank中人CysC基因序列及shRNA設計原則合成CysC-shRNA序列：5′-GCTCCTGCTGGCCATCCTG-3′，同時設計并合成陰性對照序列Ctr-shRNA：5′-TGCGAACGACTTCTTCGCC-3′；將其與T4連接酶、限制性內切酶Age Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切后慢病毒載體連接，后將其轉化TOP10大腸桿菌感受態細胞，并將其接種于含青霉素-鏈霉素溶液的LB平板上繼續培養16 h，挑取菌落進行測序，挑選序列正確克隆構建CysC-shRNA重組慢病毒和CysC-shRNA重組慢病毒，并將其轉染293T細胞進行包裝、濃縮及滴度測定，以上步驟均在上海吉瑪基因化學有限公司幫助下完成。

1.2.3 重組慢病毒感染A549細胞 將CysC-shRNA和Ctr-shRNA重組慢病毒分別感染處于對數生長期的A549細胞，繼續培養72 h，后在熒光倒置顯微鏡下觀察各組GFP表達情況。

1.2.4 用qRT-PCR檢測各組CysC mRNA水平 收集轉染后處于對數生長期的各組單細胞懸液進行檢測，參考總RNA提取和逆轉錄試劑盒操作說明書進行總RNA提取和cDNA合成，后采用qRT-PCR法檢測各組CysC mRNA水平，其中CysC上下游引物分別為：5′-GCTCTTTCCAGATCTACGCT-3′和5′-AGGCAGCCGATGCTACTATT-3′；反應體系(20 μL)：cDNA產物1 μL、上下游引物各0.5 μL、SYBR Green Master mix液 10 μL和雙蒸水8 μL；反應條件：95℃ 15 s、95℃ 5 s、60℃ 30 s，共循環45次，內參基因是GAPDH，以2-ΔΔCT描述CysC mRNA相對表達水平。

1.2.5 MTT實驗 轉染后，調整各組細胞密度至1×104個/mL，并將其接種于96孔板上，每孔添加100 μL，并設置3個復孔，繼續培養，并分別于第1、3和5天向每孔中避光加入20 μL 5 mg/mL MTT液，混勻，繼續培養4 h，棄孔中廢液，并向每孔加入100 μL DMSO液，搖床振蕩 3 min，放酶標儀上檢測 490 nm處各孔OD值，以OD值表示細胞增殖能力。

1.2.6 細胞克隆形成實驗 轉染后，調整各組細胞密度至1×104個/mL，并將其接種于6孔板上，每組設置3個復孔，繼續培養，每隔2～3 d換液1次，并于倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況，培養10～12 d后，用4%多聚甲醛固定細胞30 min，再用結晶紫染色15～25 min，待其自然干燥后觀察細胞集落生長情況，并拍照。

1.2.7 Western blot實驗 轉染后，收集各組對數生長期細胞，參考總蛋白提取試劑盒提取總蛋白，用BCA蛋白試劑盒進行蛋白定量分析，后進行Western blot實驗：(1)按需要配置不同濃度分離膠和濃縮膠；(2)向槽中填滿2×電泳緩沖液，平穩拔出梳子，按每孔50μg計算上樣量，將不同體積蛋白及蛋白Marker依次加入孔內；(3)設置電流為 120 mA，通電1 h進行電泳；(4)在Marker標示下按不同蛋白大小切膠，再按濾紙-膠-PVDF膜-濾紙結構依次擺放，將蛋白恒流轉至 PVDF膜；(5)加封閉液使其封閉；(6)向每條膜加入稀釋后的β-actin、PI3K和Akt單克隆抗體，4℃過夜；(7)TBST洗膜；(8)再向每條膜上加入稀釋好的二抗，37℃1 h，TBST洗膜；(9)ECL顯影。

2 結果

2.1 熒光顯微鏡下觀察轉染效果 重組慢病毒感染A549細胞，72 h后于熒光顯微鏡下觀察CysC-shRNA組和Ctr-shRNA組GFP表達情況(圖1)，發現CysC-shRNA組GFP表達水平明顯低于Ctr-shRNA組，提示重組慢病毒構建成功。

注：A:Ctr-shRNA組;B:CysC-shRNA組

2.2 重組慢病毒沉默效果鑒定 用qRT-PCR檢測各組CysC mRNA水平評估沉默效果，CysC-shRNA組、Ctr-shRNA組和空白對照組CysC mRNA水平比較差異有統計學意義(P<0.05)，CysC-shRNA組CysC mRNA水平明顯低于Ctr-shRNA組和空白對照組(t=31.508、P=0.000,t=29.113、P=0.000)；提示沉默效果好。見表1。

表1 各組CysC mRNA水平比較

2.3 各組細胞增殖能力比較 從第1天開始，CysC-shRNA組、Ctr-shRNA組和空白對照組3組OD值比較差異有統計學意義(P<0.05)，以CysC-shRNA組細胞增殖能力最差，Ctr-shRNA組和空白對照組無明顯差異。見表2。

表2 各組OD值比較

2.4 各組細胞集落形成能力比較 空白對照組、Ctr-shRNA組和CysC-shRNA組細胞集落形成個數分別為(83±16)個、(80±14)個和(15±3)個，CysC-shRNA組集落形成數量明顯低于Ctr-shRNA組和空白對照組(P<0.05)，但Ctr-shRNA組和空白對照組比較則差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

注：A:空白對照組;B:Ctr-shRNA組;C:CysC-shRNA組

2.5 各組PI3K和Akt蛋白含量比較 CysC-shRNA組PI3K和Akt蛋白明顯低于Ctr-shRNA組和空白對照組，但后兩組比較則差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 各組PI3K和Akt蛋白含量比較

3 討論

以手術治療為主、放化療為輔的綜合治療方式是目前NSCLC的治療方案，但多數患者易復發，且轉移率較高，導致病死率居高不下，因此探討NSCLC的具體發病機制對患者預后十分重要[8]。近年，國內外學者對腫瘤微環境研究較多，且發現其與腫瘤發生、發展及預后密切相關，而微環境中蛋白酶異常則是其主要特征之一，主要包括金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶三類，以利于腫瘤細胞進入血液或淋巴循環,并到達特異部位繼續生存[9-10]。研究表明，在乳腺癌、頭頸癌及肺癌等多數惡性腫瘤中存在蛋白酶高水平表達，導致腫瘤預后不良[11-12]。CysC則是一種重要的蛋白酶抑制劑，這是因為該蛋白C端有2個二硫鍵，可抑制半胱酸蛋白酶B、H及L等，保護細胞免受異常蛋白酶水解，同時參與調控細胞內外其他蛋白酶表達[13-14]。研究顯示，半胱氨酸蛋白酶是CysC的主要底物，而半胱氨酸蛋白酶活性紊亂是腫瘤轉化的重要特征之一[15]。研究發現，CysC在惡性腫瘤細胞中過表達，抑制死亡細胞釋放蛋白酶導致不適當降解，調控組織蛋白活性，從而促進細胞增殖、轉移及侵襲等[16-17]。Zhang等[18]和Ohara等[19]學者發現結直腸癌和肺癌中均存在CysC高表達，但均未涉及其具體作用。

shRNA是目前成熟RNA干擾技術之一，已在生物學和醫學生物學等領域得到廣泛運用。本研究基于上述CysC在肺癌中的異常高表達，采用shRNA和慢病毒重組的方式敲低CysC，從而探討其對NSCLC的影響。本研究中熒光顯微鏡下GFP表達情況及CysCmRNA水平均提示CysC-shRNA和Ctr-shRNA設計良好，沉默效率較高，保證了后續實驗結果的真實性。后續研究結果均提示敲低CysC可明顯抑制NSCLC細胞增殖及集落形成能力，與Yan等[20]研究一致，即沉默CysC可在一定程度抑制食管癌細胞EC9706增殖。那CysC是如何發生作用的呢？本研究通過Western blot實驗發現敲低CysC后，NSCLC細胞PI3K和Akt蛋白水平明顯下降，提示下調CysC抑制NSCLC細胞增殖，與PI3K和Akt蛋白有關，PI3K和Akt是PI3K/Akt信號轉導通路的關鍵因子。PI3K/Akt信號轉導通路是PI3K/Akt信號轉導通路的關鍵因子，是大部分細胞生長因子的下游通路，在肺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤中表現活躍，幫助腫瘤細胞逃避免疫，促進增殖[21]。

綜上認為，靶向下調CysC可明顯抑制NSCLC細胞增殖，與PI3K/Akt信號通路相關。