雙氫青蒿素對人宮頸癌細胞Hela生物學特性的影響

張新影,高翠紅,孫翀

1天津市津南醫院婦產科(天津 300350)；2石家莊市婦產醫院婦產科(河北石家莊 050000)；3天津市中心婦產科醫院婦產科(天津 300100)

宮頸癌是女性的頭號殺手及婦科常見的高危惡性腫瘤疾病，也是全球范圍內第三大最常見的癌癥[1]。宮頸癌的有效局部控制主要采用放射治療，放療敏感性降低導致的放射治療的臨床失敗越來越受到人們的關注，盡管如此，腫瘤放射治療敏感性降低的分子機制尚不完全清楚。臨床上藥物治療的一些不良反應和不良預后導致了緊急情況下需要使用新的化學治療劑。而最近的研究表明[2]，抗瘧藥青蒿素及其衍生物可顯著抑制宮頸癌細胞的增殖，已使用多年成功治療人類瘧疾和病毒。雙氫青蒿素(DHA)是青蒿素(ART)的活性代謝產物，可對多種人類癌癥包括子宮頸癌、乳腺癌、卵巢癌和結直腸癌細胞等有細胞殺傷作用毒性發揮作用。最近的研究表明，其抗癌活性包括DHA在內的ART衍生物主要是通過鐵介導的過氧化物橋的裂解來實現[3]。癌細胞膜上轉鐵蛋白受體數量和胞內Fe2+濃度遠高于正常細胞，DHA對癌細胞具有選擇性毒性。此外，臨床試驗已經表明，人體對ART衍生物微量藥物具有很好的耐受性，在瘧疾治療中沒有發現明顯的不良反應，可見DHA在腫瘤學上具有重要的潛力[4-5]。但是，它的作用機制還沒有闡明。因此，2018年10月至2019年8月我們開展本實驗主要探索DHA對人宮頸癌Hela細胞的影響及相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料 Hela細胞株(中國科學院,北京)，Trizol試劑盒、胎牛血清、RPMI 1640培養基(北京沃比森科技有限公司)雙氫青蒿素、Bax、caspase-3、GAPDH單克隆抗體(sigma公司，美國)，Matrigel基質膠(BD生物技術公司,美國)，Western blot試劑盒、IP細胞裂解液(碧云天生物技術研究所)；PVDF(美國Millipore公司)；相關引物(由上海生工生物工程有限公司合成)；普通光學倒置顯微鏡(Nikon)、流式凋亡及細胞周期試劑盒、Annexin V-FITC/PI試劑盒(上海吉凱公司)CO2培養箱(Thermo)。

1.2 細胞培養和分組 人宮頸癌細胞株Hela細胞培養于含10% 小牛血清及100 U/mL左氧氟沙星的RPMI 1640培養基中，于5%CO2及37℃條件下密閉式孵箱內培養，每1～2 d行細胞傳代，后續實驗均取對數生長期的細胞。按密度為每毫升 2×105個的宮頸癌Hela細胞接種于 6 孔板,每孔 3 mL,于5%CO2及37℃條件下密閉式孵箱內培養 24 h?？瞻讓φ战M(加入等體積生理鹽水)、低濃度DHA組 (50 μmol/L)及高濃度DHA 組(400 μmol/L)。48 h后進行后繼檢測

1.3 RT-PCR檢測 分組及加藥情況同1.2，培養48 h后收集三組Hela細胞，加入TRIzol試劑裂解細胞抽提總RNA。根據逆轉錄說明書合成相應的cDNA并進行擴增。條件如下95℃行預變性60 s，95℃下變性30 s，59℃退火30 s，71℃延伸30 s，共40個循環。Bax上游引物：5′-ACACCTGAGCTGACCTTGGA-3′，下游引物：5′-CCGTGTCCACGTCAGCAATC-3′，引物長度為133 bp；Caspase-3上游引物：5′-AGAGCTGGACTGCGGTATTGAG-3′，下游引物：5′-GAACCATGACCCGTCCCTTG-3′，引物長度為148 bp;內參GAPDH上游引物：5′-CGTGGAAGGACTCATGACCA-3′，下游引物：5′TCCAGGGGTCTTACTCCTTG-3′，引物長度為509 bp。以GAPDH為內參，測定Caspase-3、Bax mRNA相對表達水平。

1.4 Western blot檢測 分組及加藥情況同1.2，培養48 h后收集三組Hela細胞，加入RIPA蛋白裂解液中，提取總蛋白，通過BCA法測定各組蛋白含量，10%聚丙烯酰氨凝膠(SDS-PAGE)電泳，15 mA電泳3 h轉膜至聚偏氟乙稀(PVDF)膜，然后置于4℃條件下進行封閉2 h，Bax、caspase-3及GAPDH一抗(1∶1 000)孵育過夜，二抗(1∶1 500)室 溫孵育1 h，暗室加入ECL發光液后曝光后顯影，X線膠片照相，行灰度值分析。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡 分組及加藥情況同1.2，培養48 h后收集三組Hela細胞，將細胞制成單細胞懸液，1 000 r/min離心5 min沉淀細胞孵育緩沖液洗1次，用100 μL的Annexin V-PI標記溶液重懸細胞，室溫下避光孵育15 min，加入熒光(SA-FLOUS)溶液，避光4℃下振動孵育20 min，上流式細胞儀檢測。實驗重復至少3次。

1.6 流式細胞儀檢測細胞周期 分組及加藥情況同1.2，培養48 h后收集三組Hela細胞，于37℃下，胰蛋白酶(濃度為0.25%)消化后，1 500 r/min，離心10 min，離心半徑15 cm，除去細胞固定液，通過預冷的70%乙醇固定細胞過夜，PBS洗1次后加入PI的染色液(含RNase A) 0.5 mL，避光于37℃下溫浴30 min，冰浴放置保存，流式細胞儀行細胞周期檢測，實驗重復3次。

1.7 克隆形成實驗 分組及加藥情況同1.2，培養48 h后收集三組Hela細胞，于 37℃、5%CO，環境下連續培養14 d。通過甲醇固定 30 min后，經過0.5%結晶紫染色30 min后，于光鏡下對含 50個細胞以上的克隆數計數。

1.8 Transwell侵襲實驗 分組及加藥情況同1.2，培養48 h后收集三組Hela細胞，按50 μg/孔Matrigel 包被Transwell小室底部膜，下室內為含10% FBS的RPMI 1640培養基500 μL/孔，向上室加入每組200 μL(3×105/mL)細胞懸液，于孵育箱內常規培養24 h后取出，拭去上室未穿膜細胞，4%多聚甲醛固定后,結晶紫染色5 min,于顯微鏡下計數穿膜細胞。

2 結果

2.1 Caspase-3、Bax mRNA表達水平 RT-PCR檢測顯示Caspase-3、Bax mRNA表達空白對照組、低濃度DHA組分別為1.01±0.09、0.98±0.06，1.46±0.12、1.42±0.14，高濃度DHA 組為2.45±0.27、2.37±0.21，明顯高于上述兩組(P<0.05)，因此，DHA干預調高Caspase-3、Bax mRNA在宮頸癌Hela細胞的表達，可能通過該途徑調控誘導細胞凋亡，見圖1。

注：A:Caspase-3、Bax mRNA電泳圖；B:Caspase-3、Bax mRNA的表達

2.2 Caspase-3、Bax蛋白表達水平 Western blot檢測顯示Caspase-3、Bax蛋白表達空白對照組、低濃度DHA組分別為0.48±0.07、0.51±0.08，0.95±0.11、1.03±0.12，高濃度DHA 組為2.28±0.21、2.35±0.23，明顯高于上述兩組(P<0.05)，因此，DHA干預調高Caspase-3、Bax蛋白在宮頸癌Hela細胞的表達，可能通過該途徑調控誘導細胞凋亡，見圖2。

注：A:Caspase-3、Bax蛋白的電泳圖；B:Caspase-3、Bax 蛋白的表達

2.3 細胞周期及凋亡率變化 細胞周期結果顯示G0/G1期與S 期細胞空白對照組、低濃度DHA組分別為53.52±3.98、32.84±3.18，61.64±3.92、22.47±2.31，高濃度DHA 組為76.48±5.26、13.25±1.22，細胞周期阻止于G0/G1期(P<0.05)，S期細胞數減少(P<0.05)；凋亡率結果顯示高濃度DHA 組凋亡率為(20.41±0.92)%，明顯高于空白對照組和低濃度DHA組[(2.84± 0.61)%、(10.36±0.63)%](P<0.05)。可見DHA干預后Hela細胞凋亡率升高，高濃度DHA較低濃度效果明顯(P<0.05),見表1,圖3。

注：A：空白對照組；B：低濃度DHA組;C:高濃度DHA 組

表1 各組細胞周期的分布以及凋亡率

2.4 Hela細胞增殖活力 平板克隆實驗顯示高濃度DHA 組細胞克隆形成數為(62.54±12.46)個，明顯低于空白對照組和低濃度DHA組[(188.56±14.84)個,(119.56±14.62)個](P<0.05)，可見DHA干預后Hela細胞增殖活力降低,高濃度DHA較低濃度效果明顯(P<0.05)，見圖4，表2。

注：A:空白對照組;B:低濃度DHA組;C:高濃度DHA 組

表2 每組細胞克隆形成數和穿膜細胞數 個

2.5 Transwell侵襲實驗 Transwell侵襲實驗穿膜細胞數高濃度DHA 組為(92.75±13.54)個，明顯低于空白對照組和低濃度DHA組[(232.58±26.42)個,(128.75±22.16)個](P<0.05)?？梢奃HA干預抑制了 PATU8988細胞的侵襲能力，高濃度DHA較低濃度效果明顯(P<0.05)，見圖5，表2。

注：A：空白對照組；B：低濃度DHA組；C：高濃度DHA 組

3 討論

DHA被世界衛生組織推薦為有效的抗瘧復方中藥。最近研究表明DHA可對多種癌細胞的生存能力發揮作用[6]。DHA是青蒿素的活性代謝物，據報道它抑制了一些癌細胞體外培養及抑制病毒誘導的小鼠腫瘤的形成[7]。最近的一些研究表明DHA在不同細胞系中的作用與DHA介導的細胞凋亡和細胞周期調控有關。有研究表明DHA對癌細胞的抑制作用是基于p53和線粒體的激活細胞凋亡途徑，DHA可通過p53非依賴性Caspase-9介導的途徑誘導細胞凋亡，抑制宮頸癌細胞的增殖[8]。DHA在多種癌細胞中的細胞毒性已經被許多研究證明[9-11]。然而，DHA的抗癌作用機制還沒有充分的證據。

據報道，DHA可通過誘導對癌細胞產生抑制、凋亡作用。DHA治療已被證明會導致線粒體膜去極化、細胞色素c釋放和Caspase活化[12]。已有研究表明，DHA可誘導Bax蛋白表達上調，促進癌細胞凋亡[13]。而且，一些臨床試驗報告顯示，DHA可通過抑制細胞增殖，促進細胞凋亡改善臨床晚期子宮頸癌患者的癥狀[14-16]。在本研究中我們使用不同濃度的DHA處理后，Caspase-3、Bax蛋白得到不同程度的上調。我們發現，高濃度DHA 組中Caspase-3、Bax蛋白表達明顯高于空白對照組及低濃度DHA組，表明DHA通過上調Caspase-3和Bax抑制宮頸癌的生長。

此外，通過流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡變化我們發現，DNA損傷誘導G1期阻滯，DNA損傷誘導最顯著的阻滯發生在G0/G1期，S期延遲進展。因此我們推測DHA能抑制Hela細胞的細胞周期、促進細胞凋亡。我們采用平板克隆實驗檢測DHA作用 Hela細胞后的細胞增殖情況，結果表明DHA對Hela細胞有增殖抑制作用。實驗結果顯示高濃度DHA 組細胞克隆形成數明顯低于空白對照組和低濃度DHA組，表明其伴有劑量依賴性。我們采用Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲力，結果顯示高濃度DHA 組的穿膜細胞數明顯低于空白對照組和低濃度DHA組，說明DHA對Hela細胞有降低細胞侵襲能力的作用，且其伴有劑量依賴性。

總而言之，我們對人宮頸癌Hela細胞進行DHA處理后，Caspase-3、Bax蛋白表達迅速上調。此外，我們證明了高濃度DHA 可以加速人宮頸癌Hela細胞的凋亡，降低細胞侵襲能力，DHA在Hela細胞中可表現出良好的抗腫瘤作用。上述這些結果將為DHA用作癌癥治療目標提供了證據支持，這種抗瘧藥的臨床應用可以擴展以補充癌癥治療藥物戰略。盡管取得了這些進展，但是治療后細胞死亡途徑上游信號傳導與下游激活的確切聯系與DHA的關系尚不清楚，有待進一步研究闡明。