紫花苜蓿揮發性成分萃取條件優化與定性、定量分析

袁 寧，特日格樂，孫 林，賈玉山，格根圖，王志軍，盧 強，李宇宇，李俊峰，孫鵬波

（1.內蒙古農業大學草原資源環境學院 / 農業部飼草栽培加工與高效利用重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010000；2.內蒙古農業大學生命科學學院，內蒙古 呼和浩特 010000；3.內蒙古自治區農牧業科學院，內蒙古 呼和浩特 010000）

揮發性成分是一類具有低分子量、高蒸氣壓、低水溶性特點的化合物，在20 ℃、0.01 kPa 下能快速揮發，成為氣相狀態[1]。揮發性成分主要包括醇、醛、酮、酯、酸、烯烴等物質，它們是自然界動植物信息交流的重要介質，植物代謝所釋放的揮發性成分不僅能夠調節植物自身生長發育，而且對于抵御病蟲害有著重要作用[2-4]。揮發性成分對氣候變化的影響也日益明顯，國外研究者認為隨著亞馬孫雨林面積的不斷減少，雨季中異戊二烯的下降趨勢明顯，這可能是雨林生物量減少所致，旱季時倍半萜烯與異戊二烯的比例上升趨勢明顯，這表明氣候變化引起的溫度上升使得揮發性成分的排放量發生變化[5]。研究顯示植物釋放的揮發性成分能顯著改善空氣質量，使空氣中負離子顯著增加[6]。國內外學者對于揮發性成分的研究多集中在環境保護方面，植物釋放的揮發性成分對于小氣候的形成和環境的改善有顯著作用[6]。飼用型牧草的揮發性成分是影響飼草適口性的關鍵因素，新鮮苜蓿干草有著濃郁的草香味，家畜的采食量高，而隨著貯藏時間的延長干草因微生物的代謝作用而產生酸味、霉味等氣味，導致家畜采食量明顯下降。錢佳成和宋偉[7]研究發現玉米（Zea mays)籽實含水量為14%～15%，儲藏溫度 ＞ 25 ℃時極易霉變，含水量低的玉米籽實苯乙醇含量較高，通過香蘭素、不飽和烯烴、不飽和烯醇化合物可有效判斷玉米儲藏狀態。萬立昊等[8]研究玉米霉變發現二氫-β-紫羅蘭酮、欖香烯、棕櫚酸、3-辛酮等的含量在玉米霉變后檢出量較高且刺激性氣味較重。鄭云飛[9]研究發現稻谷隨著儲藏時間的延長醛類和酮類物質逐漸降低。由此推斷儲備多年的飼草適口性變差，家畜采食量降低，可能與紫花苜蓿（Medicago sativa)揮發性成分主要貢獻物質的降低有關，飼草喪失了原本的草香味，家畜不喜采食，儲備多年的飼草家畜采食量顯著降低。因此，明晰牧草揮發性成分的變化，對于飼草安全貯藏與養殖業安全生產具有重要作用。

紫花苜蓿是豆科苜蓿屬飼草作物，高蛋白、低纖維、維生素礦物質豐富、氨基酸種類齊全、飼用價值高等優勢使得其在世界范圍內廣泛種植，隨著畜牧業的發展，我國苜蓿產業的種植、收獲、加工、貯藏技術也不斷向著機械化、科學化、綜合化發展[10-11]。如何提高苜蓿品質也成為制約產業發展的關鍵因素，其中苜蓿的揮發性成分是影響苜蓿適口性的關鍵因素。本研究采用頂空固相微萃取—氣相色譜—質譜聯用（headspace solid phase microextraction—gas chromatography—mass spectrometry, HS—SPME—GC—MS)技術，探討萃取溫度、解析溫度、萃取時間、解析時間對紫花苜蓿揮發性成分種類與含量的影響，在最佳萃取條件下對揮發性成分進行定性、定量分析，旨在為紫花苜蓿揮發性成分鑒定提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

萃取條件對揮發性成分的種類與含量有很大影響，本試驗通過單因素試驗探討不同萃取溫度、解析溫度、萃取時間、解析時間（表1)下采用GC-MS檢測出紫花苜蓿揮發性成分種類與含量的差異，以期篩選出最佳萃取條件與該條件下紫花苜蓿揮發性成分的種類與相對含量。

表1 單因素試驗Table 1 Single factor test

1.2 試驗材料

試驗材料為2020 年6 月采自包頭市九原區鑫泰農業有限公司的‘中苜三號’紫花苜蓿，干草含水量為12%，去除苜蓿干草中的雜草，0.147 mm 篩粉碎后裝入自封袋內，保存在-80 ℃超低溫冰箱中待用。

1.3 試驗儀器

1.4 測定方法

1.4.1 紫花苜蓿揮發性成分測定前處理方法

萃取前需將萃取頭在GC-MS 進樣口進行老化，老化溫度250 ℃，老化30 min。準確稱取1.5 g 苜蓿干草樣品放入20 mL 頂空瓶中，用密封膠墊和鋁蓋進行密封。頂空瓶放在磁力加熱攪拌器上使其均勻受熱，苜蓿干草中的揮發性成分可穩定快速地揮發出來，將老化后的萃取頭插入頂空瓶，纖維頭暴露在頂空瓶中使其充分吸附紫花苜蓿揮發性成分。吸附一段時間后，將萃取頭插入GC-MS 進樣口內，使載氣不斷將吸附到纖維頭上的揮發性成分吹入GC-MS中，進行分析，每份樣品重復3 次。

1.4.2 氣相色譜—質譜分析條件

氣相色譜—質譜條件參考Laopongsit 等[12]、李宇宇等[13]方法。色譜條件：使用HP-5MS UI 石英毛細管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)，柱初溫為35 ℃，保持4 min，以5 ℃·min-1程序升溫至200 ℃，保持5 min，再以15 ℃·min-1程序升溫至250 ℃，保持4 min，進樣口溫度為250 ℃，載氣為高純度氦氣（純度≥99.99%)，氦氣流速為1 mL·min-1，柱前壓為87.57 kPa，進樣模式為分流，分流比為1 ∶ 20，進樣方式為手動進樣。質譜條件：離子源溫度為230 ℃，傳輸線溫度為280 ℃。電離方式EI 離子源，電子能量70 eV。質量掃描范圍40～550 m·z-1，采集方式為全掃描方式，離子源真空度為7.2 × 10-7mTorr。

1.5 數據處理

根據NIST11 和NIST11s 數據庫對紫花苜蓿揮發性成分進行定性分析，采用峰面積歸一化法求各化合物的相對含量。

2 結果與分析

2.1 萃取溫度對紫花苜蓿揮發性成分種類與相對含量的影響

采用頂空固相微萃取法分析在萃取時間60 min，解析時間3 min，解析溫度250 ℃，萃取溫度20、40、50、70、90 ℃條件下探究紫花苜蓿揮發性成分種類和相對含量的差異（表2)。排除部分因萃取頭高溫分解和柱流失產生的化合物外，結果顯示隨著萃取溫度的升高，揮發性成分的種類逐漸增加。萃取溫度20 ℃下共檢出7 種化合物，其中醛類化合物2 種，占總揮發物的26.01%。醇類化合物2 種，占總揮發物的32.78%。酮類化合物2 種，占總揮發物的32.07%。酯類化合物1 種，占總揮發物的9.15%。

表2 不同萃取溫度下紫花苜蓿揮發性成分種類及相對含量Table 2 Variety and relative content of volatile components of alfalfa at different extraction temperatures

續表2（1)Table 2（Continued)

續表2（2)Table 2（Continued)

萃取溫度90 ℃下共檢出47 種揮發性成分，其中醛類化合物13 種，占總揮發物的14.08%。醇類化合物10 種，占總揮發物的11.7%。酮類化合物13種，占總揮發物的46.36%。酯類化合物6 種，占總揮發物的14.62%。酚類化合物2 種，占總揮發物的9.13%。烴類化合物1 種，占總揮發物的1.35%。雜環類化合物2 種，占總揮發物的1.01%。

隨著萃取溫度升高，紫花苜蓿揮發性成分的總峰面積和出峰數逐漸增加（圖1)。但萃取溫度超過90 ℃后，高溫烘烤使紫花苜蓿失去原本鮮綠色，轉變為焦褐色并伴有焦糊氣味產生（圖2)，因此萃取溫度為90 ℃能使紫花苜蓿揮發性成分在不發生變性的情況下揮發完全。

孟導找個位子坐下，打量起坐在柜臺前的來人。來客中等身材，戴著一副學究氣的眼鏡，一副文質彬彬的打扮。年紀大概在3 5歲以后，頭發已經有些斑禿。看來和自己一樣是從事腦力工作的。嗯，不過孟導自己倒是毛發濃密，堅挺地把守著象征年紀的高地。

圖1 萃取溫度對紫花苜蓿揮發性成分總峰面積與峰個數的影響Figure 1 Effect of extraction temperature on the total peak area and peak number of alfalfa volatile components

圖2 不同萃取溫度下紫花苜蓿的顏色變化Figure 2 Color changes of alfalfa at different extraction temperatures

2.2 萃取時間對紫花苜蓿揮發性成分種類與相對含量的影響

采用頂空固相微萃取法分析在萃取溫度90 ℃，解析溫度250 ℃，解析時間3 min，萃取時間40、50、60、70、80 min 條件下紫花苜蓿揮發性成分種類和相對含量的差異（表3)。排除部分因萃取頭高溫分解和柱流失產生的化合物外，結果顯示萃取時間80 min時共檢測出52 種化合物，其中醛類化合物15 種，占總揮發物的19.31%。醇類化合物12 種，占總揮發物的21.74%。 酮 類 化 合 物9 種， 占 總 揮 發 物 的37.55%。酯類化合物6 種，占總揮發物的9.41%。酚類化合物2 種，占總揮發物的0.72%。烴類化合物5 種，占總揮發物的6.17%。雜環類化合物2 種，占總揮發物的1.22%。芳香族化合物1 種，占總揮發物的3.57%。大部分化合物的保留時間在30 min 以內，醛類、醇類、酮類化合物相對含量占比達總揮發物的70%以上，是揮發物中的主要成分。不同萃取時間下檢測到醛類化合物種類最多，酮類化合物的相對含量最高，其中β-紫羅蘭酮為含量最多的化合物，其次為苯乙醇。

表3 不同萃取時間下紫花苜蓿揮發性成分種類及相對含量Table 3 Variety and relative content of volatile components of alfalfa under different extraction times

續表3（1)Table 3（Continued)

續表3（2)Table 3（Continued)

隨著萃取時間的延長，紫花苜蓿揮發性成分總峰面積呈先增加后趨于穩定的趨勢，出峰個數呈先增加后下降再增加的趨勢，在萃取時間80 min 時總峰面積不再變化，出峰個數最多（圖3)，因此80 min是理想的萃取時間。

圖3 萃取時間對紫花苜蓿揮發性成分總峰面積與峰個數的影響Figure 3 Effect of extraction time on the total peak area and peak number of volatile components of alfalfa

2.3 解析時間對紫花苜蓿揮發性成分種類與相對含量的影響

采用頂空固相微萃取法分析在萃取時間60 min，萃取溫度90 ℃，解析溫度250 ℃，解析時間1、2、3、4、5 min 條件下紫花苜蓿揮發性成分種類和相對含量的差異。排除部分因萃取頭高溫分解和柱流失產生的化合物外，結果顯示解析時間1 min時檢測出42 種揮發性成分，但化合物的總峰面積較低，說明解析出化合物的含量較少。解析時間3 min時檢測出41 種化合物，總峰面積達到最大。解析時間超過3 min 后揮發性成分的種類和總峰面積同時開始下降（圖4)，因此解析時間3 min 可以將萃取頭上大部分化合物解析下來。

圖4 解析時間對紫花苜蓿揮發性成分總峰面積與峰個數的影響Figure 4 The influence of resolution time on the total peak area and peak number of alfalfa volatile components

解析時間1 min 時共檢測出42 種化合物（表4)，其中醛類化合物11 種，占總揮發物的22.36%。醇類化合物6 種，占總揮發物的20.90%。酮類化合物14 種，占總揮發物的41.44%。酯類化合物5 種，占總揮發物的10.40%。烴類化合物2 種，占總揮發物的2.04%。雜環類化合物2 種，占總揮發物的1.34%。酚類化合物1 種，占總揮發物的0.77%。芳香族化合物1 種，占總揮發物0.78%。

表4 不同解析時間下紫花苜蓿揮發性成分種類及相對含量Table 4 Variety and relative content of alfalfa volatile components under different resolution times

續表4Table 4（Continued)

解析時間3 min 時共檢測出41 種化合物（表4)。其中醛類化合物12 種，占總揮發物的22.41%。醇類化合物6 種，占總揮發物的17.94%。酮類化合物11 種，占總揮發物的41.07%。酯類化合物5 種，占總揮發物的11.95%。烴類化合物3 種，占總揮發物的1.89%。雜環類化合物2 種，占總揮發物的0.98%。酸類化合物1 種，占總化合物的0.24%。芳香族化合物1 種，占總化合物的3.48%。大部分化合物保留時間均在30 min 以內，醛類、醇類、酮類化合物的相對含量占總化合物的80%以上，醛類化合物種類較多，酮類化合物相對含量較高。其中β-紫羅蘭酮、苯乙醇與二氫獼猴桃內酯的相對含量較高。

2.4 解析溫度對揮發性成分種類與相對含量的影響

采用頂空固相微萃取法分析在萃取時間60 min，萃取溫度90 ℃，解析時間3 min，解析溫度230、240、250、260、270 ℃條件下紫花苜蓿揮發性成分種類和相對含量的差異。排除部分柱流失外，結果顯示隨著解析溫度的升高，紫花苜蓿揮發性成分總峰面積與出峰個數先增加后減少，在250、260 ℃同時檢測出55 種揮發性成分，但總峰面積在解析溫度250 ℃時達到最大（圖5)，因此選擇解析溫度250 ℃較為理想。

圖5 解析溫度對紫花苜蓿揮發性成分總峰面積與峰個數的影響Figure 5 Effect of resolution temperature on the total peak area and peak number of alfalfa volatile components

解析溫度250 ℃時共檢測出51 種化合物（表5)。其中醛類化合物15 種，占總揮發物的28.05%。醇類化合物10 種，占總揮發物的20.74%。酮類化合物9 種，占總揮發物的29.64%。酯類化合物3 種，占總揮發物的8.19%。烴類化合物11 種，占總揮發物的8.19%。雜環類化合物2 種，占總揮發物的1.83%。芳香類化合物1 種，占總揮發物的1.25%。解析溫度250 ℃條件下化合物的種類最多，化合物的相對含量較高，大部分化合物保留時間基本在30 min 以內，醛類化合物的種類較為豐富，酮類化合物的相對含量較高。

表5 不同解析溫度下紫花苜蓿揮發性成分種類及相對含量Table 5 Variety and relative content of alfalfa volatile components under different resolution temperatures

續表5（1)Table 5（Continued)

續表5（2)Table 5（Continued)

3 討論

萃取條件對HS-SPME 的萃取能力有很大影響，白俊英等[14]、薛妍君等[15]研究表明高溫有利于揮發性物質的吸附，萃取溫度低，揮發性成分揮發較慢或揮發不完全，達到平衡的時間較長。因此紫花苜蓿的揮發性成分種類較少，相對含量較低；隨著溫度的升高，分子運動加快，更能激發萃取頭對揮發性物質的快速吸附，縮短達到平衡的時間，紫花苜蓿揮發性成分的種類較為豐富，相對含量較高。萃取溫度過高會破壞紫花苜蓿原有品質，導致揮發性組分發生變化。本研究表明萃取溫度超過90 ℃紫花苜蓿會產生焦糊味，且喪失原本的鮮綠色，導致部分化合物高溫分解變性，分析鑒定出的化合物極大可能不是紫花苜蓿原本的揮發物質，因此90 ℃為理想萃取溫度，與侯佳寧等[16]研究結果一致。

頂空瓶中的樣品、頂空瓶上部空間與萃取纖維三者之間達到平衡所需的時間稱為萃取時間，通過加熱等方式均可以縮短萃取時間[17]。萃取時間主要受樣品本身的性質影響較大，不同的樣品萃取時間不同。本研究顯示隨著萃取時間的增加揮發性成分總峰面積和出峰個數逐漸增加，到80 min 時基本穩定，與李凱等[18]的研究結果一致。

解析時間是影響萃取效果最主要的因素[13]。解析時間短，載氣對萃取纖維吹掃不完全，導致樣品不能完全從萃取纖維上剝離，最終影響萃取效果，若萃取時間太長，由于進樣口溫度達250 ℃，長時間的高溫會使萃取纖維脫落，產生流失，甚至可能污染進樣口與色譜柱。本研究表明解析時間3 min、解析溫度250 ℃時萃取效果較好，與李宇宇等[13]的研究結果一致。

張靜靜等[19]研究顯示3-戊酮、順-2-戊烯醇、葉醇、4-甲基-1-戊醇、3-辛酮、2-乙基己醇、苯乙醇在紫花苜蓿中含量較高，同時作者推斷可能是這幾種物質相互配比后對苜蓿害蟲具有吸引作用，該研究結果為苜蓿害蟲防治提供了理論依據。李存滿等[20]研究發現紫花苜蓿揮發油中主要以酸、醇、酮、酯類化合物為主，這與本研究結果類似。劉照娟等[21]采用同時蒸餾法分析紫花苜蓿揮發性成分，發現植醇、β-紫羅蘭酮等6 種揮發性成分含量較高，這與本研究結果類似。

本研究中紫花苜蓿揮發性成分中醛類、酮類、醇類化合物的占比較高，其中β-紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內酯、苯乙醇、1-辛烯-3-醇等化合物相對含量較高，對紫花苜蓿揮發性成分貢獻較大。

4 結論

不同的萃取條件對紫花苜蓿揮發性成分的種類和含量有很大的影響，研究結果表明：萃取溫度90 ℃、萃取時間80 min、解析溫度250 ℃、解析時間3 min為最佳萃取條件。該萃取條件下紫花苜蓿中共檢測出52 種化合物，包括酮類化合物9 種，占總揮發物的37.55%；醇類化合物12 種，占總揮發物的21.74%；醛類化合物15 種，占總揮發物的19.31%；酯類化合物6 種，占總揮發物的9.41%；烴類化合物5 種，占總揮發物的6.17%；芳香族化合物1 種，占總揮發物的3.57%；雜環類化合物2 種，占總揮發物的1.22%；酚類化合物2 種，占總揮發物的0.72%。其中β-紫羅蘭酮含量可達到總揮發物的20%左右，反式-2-己烯醛、2-苯基乙醛、壬醛、癸醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、3, 5, 5-三甲基環己-2-烯酮、胡薄荷酮等對紫花苜蓿揮發性成分貢獻較大，由于醇類、酯類、烴類物質有較高的閾值，因此對紫花苜蓿揮發性成分貢獻可能不大。