血清miR-181b與冠狀動脈狹窄程度的相關性分析

劉玉芝，任玉華，王雪，張少陽

（聊城市人民醫院心內科，山東 聊城 252000）

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是冠狀動脈血管發生動脈粥樣硬化病變而引起血管狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而導致的心臟病。我國冠心病（CHD）的發病率呈逐年升高的趨勢，嚴重威脅人們的生活質量和健康，其主要的發病原因為各種危險因素對動脈內皮的損傷和脂質在動脈內膜層的積聚，導致動脈壁的慢性炎癥，逐漸形成粥樣斑塊。在動脈粥樣硬化（AS）中，異常的脂質位于血管壁內膜下，介導形成泡沫細胞，進而導致血管內皮功能障礙和炎癥反應[1]。在此過程中，免疫細胞、淋巴細胞和樹突狀細胞被激活，一些細胞因子被釋放，進一步增加炎癥反應。隨后，巨噬細胞、血小板和平滑肌細胞被激活，從而顯著增加炎性物質，加重斑塊的不穩定性和破裂，進而加重疾病的發展程度[2]。

近年來，基因調控因子微核糖核酸（miRNA）、AS 及心血管疾病相關性研究增多。如miR-208a、miR-133a 參與心肌肥厚，miR-155在冠心病患者血漿中顯著下降，miR-143/145通過改變細胞結構，增強血管平滑肌細胞的增殖，miR-2 也參與血管平滑肌細胞增殖和血管新生內膜病變的形成，micoRNA-195 參與心臟重塑的病理過程。Yao 等[3]研究發現miR-181 家族可能參與動脈粥樣硬化的調控。其中miR-181b 是 miR-181 家族在心血管細胞中的主要表達亞型［4］。本研究旨在分析miR-181b與冠狀動脈狹窄程度之間的相關性，為進一步發現miRNA在冠狀動脈斑塊形成和心血管治療中的作用提供新的依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019 年1 月至2019 年12 月本院心內科收治的冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者180 例為研究對象，根據Gensini 積分（見表1）分為≤25 分組（n=71）、26～50分組（n=53）、＞50分組（n=56），選取同期行冠狀動脈造影結果正常的35名作為對照組，所有研究對象年齡38～78歲，平均（60.82±8.24）歲。本研究經本院倫理委員會審核批準，患者知情同意并簽署知情同意書。

表1 Gensini積分Table 1 Gensini score

納入標準：年齡＜85 歲者；2 個月內無手術、外傷、感染性疾病者；無肝臟疾病、腎功能衰竭者；無惡性腫瘤者；無結締組織病或自身免疫性疾病者；非急性出血，輸血期者；無甲狀腺功能異常者；非接受放療、化療者；非腦梗病史或其他血栓病史者。排除標準：臨床資料不完整者；中途退出者；拒絕參與本研究者。

1.2 方法

1.2.1 臨床一般指標檢測 所有研究對象入院后第2天清晨空腹采集超敏CRP（hs-CRP）、Cr、BUN、TC、TG、HDL-C、LDL-C等血標本進行化驗。

1.2.2 血清miR-181b相對表達量檢測 采用實時熒光定量PCR法（qRT-PCR）測定血清miR-181b相對表達水平。具體方法為：提取血清1份，并檢測總RNA純度比值，范圍為1.6～2.0。按Takara反轉錄試劑盒說明書反轉錄為cDNA。將反轉錄cDNA 進行PCR 擴增，擴增條件為 95 ℃ 30 s，60 ℃ 60 s，循環45次。采用2-△△Ct法計算miR-181b mRNA的相對表達量。

1.3 觀察指標 分析血清miR-181b 與冠狀動脈狹窄程度的相關性 分別測定4組血清miR-181b水平，比較其與冠狀動脈狹窄程度的相關性。

1.4 統計學方法 采用SPSS 23.0統計軟件進行數據分析，所有統計指標均進行正態檢驗和方差齊性檢驗，服從正態分布的計量資料采用“”表示，采用單因素方差分析；不服從正態分布的計量資料采用秩和檢驗；計數資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗；采用直線回歸相關分析血清miR-181b水平與臨床及病理指標的關系，以P＜O.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4組血清miR-181b相對表達水平及臨床資料比較 對照組miR-181b水平高于≤25分組、26～50分組及＞50分組，差異有統計學意義（P＜0.05）；≤25分組、26～50分組及＞50分組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；≤25分組與26～50分組比較差異無統計學意義。≤25分組、26～50分組、＞50分組hs-CRP 水平均高于對照組（P＜0.05）；＞50 分組高于≤25 分組、26～50分組（P＜0.05）；≤25分組與26～50分組比較差異無統計學意義；其他指標比較差異無統計學意義，見表2。

表2 4組miR-181相對表達水平及臨床資料比較Table 2 Comparison of relative expression levels and clinical data of miR-181b among the four groups

2.2 血清miR-181b 相對表達水平與hs-CRP 直線相關分析血清miR-181b相對表達水平與hs-CRP呈負相關（r=-0.767，P＜0.001），見圖1。

圖1 血清miR-181b與hs-CRP直線相關分析Figure 1 Linear correlation analysis of serum miR-181b and hs-CRP

3 討論

miR-181b 屬于 miR-181 家族 ，miR-181 是典型的具有內含子性質的非編碼RNA 分子家族，其中包括4 個成熟的miRs：miR-181a，miR181b，miR181c，miR181d，由位于3 條不同的染色體上的6個主miRs序列編碼構成，靶基因主要參與細胞修復、炎性反應、調控細胞增生等生物學過程[5-7]。有研究表明，miR-181b 是miR181 家族在心血管細胞中的主要表達亞型，miR-181b能負調控促炎分子的表達，從而保護血管炎癥[4]。

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（CHD）是血脂異常、血管內皮炎性反應等多種病理因素造成的冠狀動脈管腔狹窄而引發的疾病。急性冠脈事件多由斑塊破裂和血栓形成引起，據病理學研究顯示，血小板反應介導的急性事件的發展主要取決于斑塊的組成和脆弱程度[8]。動脈粥樣硬化（AS）是一種動脈管壁的慢性進展性炎性反應，異常的脂質代謝引發動脈管壁上脂質沉積和炎性反應，可形成粥樣斑塊及血管損傷，導致AS的發生［9］。

研究表明，miRNA 在血管和炎性疾病（包括中風和斑塊破裂）的發病機制中發揮重要作用，miR-181 家族在心血管炎癥、動脈粥樣硬化斑塊形成和急性卒中事件中起關鍵作用[9-11]。Deng B[12]發現，在局灶性缺血性腦卒中大鼠中，miR-181b 的表達隨缺血程度的增加而下降，miR-181b 表達的增加可降低總動脈負荷。Sun 等［9］研究表明，miR-181b 可通過調控炎性相關因子的表達，阻礙炎性細胞的聚集和動脈粥樣斑塊形成。以往研究發現[13-14]，在易損斑塊中存在大量的巨噬細胞，這些巨噬細胞對于斑塊的破裂非常重要。miR-181b 可通過調節巨噬細胞極化來減少斑塊面積、壞死面積和巨噬細胞浸潤。Hulsmans 等［15-16］在喂食高脂肪飲食的小鼠主動脈內膜中miR-181b 下調，miR-181b 的過量表達與大鼠體質量的下降呈正相關，超重、肥胖為CHD 發病危險因素之一，表明miR-181b與CHD發病風險成負相關。本研究結果顯示，冠脈狹窄程度越重，miR-181b的表達水平越低；同時，冠脈狹窄程度越重，其血漿炎癥因子hs-CRP 水平越高，且miR-181b 的表達水平與hs-CRP 呈顯著負相關，表明miR-181b 在炎癥反應中起負調節作用，提示miR-181b 在冠狀動脈硬化中起保護作用。

關于miR-181b 對冠狀動脈硬化的保護機制尚未明確。Zhang 等[17-18]研究發現，輸入蛋白-α3 和 caspase 募集結構域蛋白-10 的低表達，可特異性下NF-κB 核轉位作用，進而導致IL-6、IL-8、TNF-α的失活，誘導型一氧化氮合酶、環氧化酶-2、細胞黏附分子-1、人血管內皮細胞黏附分子-1等細胞因子表達的下調，從而抑制炎性反應的發生。Gargi S等［19］和 Dan-Dan Xu 等［20］提出 miR-181b 與 NF-κB 之間存在NF-κB/IL-6/STAT/miR-181b調節環路，NF-κB可通過激活IL-6 依賴的STAT 通路，實現促進miR-181b 的轉錄作用，降低炎性反應。miR-181b 與NF-κB 互相作用，進一步降低動脈粥樣硬化時血管內皮炎性反應，提示miR-181b 在動脈粥樣硬化中發揮保護作用。有研究證實[21]，miR-181b 可通過抑制巨噬細胞和白細胞之間的轉化，抑制免疫細胞在炎性反應中的聚集，進一步發揮抗炎作用。miR-181b 為血管內皮和平滑肌的主要調節因子，可誘導VEC 及VSMC 的增生分化，促進組織修復［22］。P SUN等[23]發現miR-181b/Notch1信號通路對血管內皮細胞的影響，miR-181b 通過抑制Notch1 的表達來保護內皮細胞功能。Tie-Jun Li等[24]發現過表達miR-181b 可激活 PI3K 和 MAPK 通路，AKT 和 ERK1/2 磷酸化水平升高，miR-181b 可通過 PI3K、MAPK 和 JNK 通路調節細胞周期調節因子的表達來促進細胞增殖，發揮動脈粥樣硬化血管的修復作用。Di Gregoli 等［25］進行動物實驗發現，miR-181b 在小鼠動脈粥樣硬化模型中能抑制病變組織中MMP-12 和TIMP-3等金屬蛋白酶表達，可擴張血管，穩定動脈粥樣硬化斑塊。miR-181b 通過自噬調節機制，正性調節mTOR 信號通路的下游分子p70S6K的表達，負性調節自噬，延緩動脈粥樣硬化斑塊的形成。Carlos等［26］發現在CHD患者血漿中，TNF-α 可促進白細胞附著，冠狀動脈內皮細胞活性，細胞因子TNF-α 高表達可誘導miR-181b 的表達，而高表達的miR-181b 可反向抑制 TNF-α 的表達，證實 miR-181b 在 CHD 中發揮保護作用。本研究的不足之處為總體樣本量較少，組內比較樣本量相對更少；本研究主要為臨床實驗，與動物實驗比較，不可控因素相對較多，可能存在一定偏差。

綜上所述，miR-181b 在動脈粥樣硬化的進展通過各種途徑、機制可發揮保護作用，延緩冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的病情發展，有望為冠心病的治療提供新的方向。