應用分子標記輔助選擇培育抗稻瘟病恢復系R153

朱玉君 黃得潤 樊葉楊 莊杰云 沈波

（1 中國水稻研究所/水稻生物學國家重點實驗室/國家水稻改良中心，杭州310006；2 杭州師范大學生命與環境科學學院，杭州311121；第一作者：zhuyujun@caas.cn；*通訊作者：bshen65@163.com）

水稻是我國最主要的糧食作物之一，培育高產優質多抗的水稻新品種是保證國家糧食安全的重要基礎。稻瘟病是危害水稻最嚴重的病害之一。全國農技推廣網統計，2001 年至2018 年稻瘟病年均發生面積達456.0 萬hm2。國家統計局公報，2019 年我國水稻種植面積為2 969.4 萬hm2。由此可推測，稻瘟病發病面積會占到種植總面積的15.4%，且稻瘟病一旦發病，減產幅度一般為10.0%～15.0%，發病嚴重的地塊甚至顆粒不收。稻瘟病是水稻持續高產穩產的嚴重阻礙。

培育抗稻瘟病的水稻品種是減少因病害損失的有效方法。我國對培育抗稻瘟病品種高度重視，在新品種審定過程中，嚴格實行稻瘟病抗性一票否決制。但從2013 年至2017 年參加國家長江中下游稻區品種區試的800 個秈稻品種的稻瘟病抗性分析結果看，新品種對稻瘟病的抗性不高。試驗中，這800 個品種的苗葉瘟、穗瘟和穗瘟損失率在6 個鑒定點的平均病級分別為4.0 級、6.8 級和4.1 級，表現為中感、感和中感；稻瘟病綜合指數平均值為4.76，屬于中感水平。參試的品種中表現為抗的品種所占比例只有0.2%，沒有表現為高抗的品種[1]。由此可見，培育高抗稻瘟病品種任重而道遠。

挖掘優異的稻瘟病抗性基因是培育高抗病水稻品種的前提條件。目前，共檢測到100 多個稻瘟病抗性基因，其中35 個已被分離和克隆[2]。借助分子標記輔助選擇技術，部分抗性基因已應用于重要雜交稻親本的改良，如JIANG 等[3]應用9 個稻瘟病抗性基因（Pi37、Pit、Pid3、Pigm、Pi36、Pi5、Pi54、Pikm 和Pib）改良兩系不育系Y58S、廣占63S、C815S 和HD9802S，獲得51 份攜帶1 個或2 個抗性基因的品系；CHEN 等[4]應用Pi9，Pi47，Pi48 和Pi49 改良兩系不育系C815S，獲得多份聚合1～3 個抗稻瘟病基因的品系。另外，還有三系恢復系福恢673 的改良[5]，不育系華1228S[6]、恢復系R163 和R167[7]的選育均基于抗性基因的挖掘。

本研究將來源于谷梅2 號的稻瘟病抗性基因Pi25（具有抗性強、抗譜廣的特點）作為目的基因[8]，以攜帶該抗性基因的品系BL108 為供體親本，與自選恢復系恢11-32 配制組合，利用與Pi25 緊密連鎖的分子標記及功能標記進行基因型檢測，以期培育出抗稻瘟病的優良恢復系，為雜交稻品種選育提供抗病親本資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究所用水稻材料為恢復系恢11-32 和攜帶稻瘟病抗性等位基因Pi25 的品系BL108。恢11-32 是以中恢161 為母本、蜀恢85 為父本雜交后，通過系譜法選育而成的恢復系，具有良好的株葉形態，恢復力強，但感稻瘟病。BL108 來源于組合G36/中恢9308，其中G36 是從中156 和谷梅2 號重組自交系群體中篩選出的1 份攜帶Pi25 純合抗性等位基因的抗稻瘟病株系。G36 與中恢9308 雜交后，自交加代，經分子標記輔助選擇和性狀鑒定，篩選出1 份高抗稻瘟病的品系，命名為BL108[9]。

2011 年冬季在海南陵水，以恢11-32 為母本、BL108 為父本配制雜交組合。2012 年夏季在浙江杭州，種植6 株F1，成熟后挑選1 株收種。2012 年冬季在陵水種植F2群體，約500 個單株，挑選到360 個具有優良株葉形態的單株收種。2013 年夏季在杭州種植360個株系，挑選到表型優良的97 個F3單株，成熟后收獲各單株種子用于基因型鑒定。

表1 R153 的稻瘟病抗性鑒定結果

圖1 Pi25 連鎖標記Si13070C 對F3 單株的檢測結果

圖2 Pi25 功能標記CAP3/BglⅡ對候選恢復系的檢測結果

1.2 DNA 提取

取約20 粒種子置于培養皿，在光照培養箱生長1周后，在各培養皿中混取8 株幼苗葉片，參照ZHENG等[10]方法進行DNA 提取。

1.3 標記檢測

本研究所用的分子標記共2 對，與Pi25 緊密連鎖的STS 標記Si13070C[9]和功能標記CAP3/BglⅡ[11]。前者主要用于低世代大群體基因型檢測，后者用于高世代苗頭恢復系檢測。Si13070C 上游引物序列為ATAACGTGTGTCCATAACAGT， 下 游 引 物 序 列 為TTAATGACTCGTGTATAGAGC；CAP3/Bgl Ⅱ上 游 引 物序列為CCTCACGTTTCTACGTCTTG，下游引物序列為CACACCATTTCTGATGAACC，限制性內切酶為BglⅡ。PCR 擴增體系、反應條件和凝膠電泳檢測參考前人研究結果[9，11]。

1.4 稻瘟病抗性鑒定

稻瘟病抗性鑒定在福建省上杭縣茶地國家水稻新品種稻瘟病抗性區試點進行。鑒定材料種植20 株，株行距16.7 cm×16.7 cm，四周種植感病誘發品種廣陸矮4 號，葉瘟、穗頸瘟調查參照陳錦文等[12]的方法。

2 結果與分析

2.1 稻瘟病抗性基因Pi25 的檢測

應用與Pi25 緊密連鎖的STS 標記Si13070C 對97份材料進行基因型檢測，部分樣品檢測結果如圖1 所示，最終有26 份樣品呈純合型Pi25 抗性等位基因。將這26 份DNA 對應的單株于2014 年夏季在杭州種植F4株系，通過進一步表型觀察，挑選6 個株系作為候選恢復系。2014 年冬季在海南陵水，6 個F5株系分別與不育系306A 進行配組。同時，提取DNA，應用Pi25 功能標記進行基因型檢測驗證。結果表明，6 個株系均攜帶Pi25 抗性等位基因（圖2）。2015 年夏季在杭州種植6 個測交組合，其中1 個組合表現突出，將對應恢復系命名為R153。

2.2 稻瘟病抗性鑒定結果

從表1 可見，感病對照廣陸矮4 號苗瘟發病率8%，鑒定為5 級；R153 苗瘟發病率0%，鑒定為0 級。廣陸矮4 號葉瘟發病率18%，鑒定為9 級；R153 發病率7%，鑒定為4 級。廣陸矮4 號穗瘟發病率100%，鑒定為9 級；R153 發病率5%，鑒定為1 級。抗性綜合評價R153 為抗稻瘟病。

3 討論

本研究通過分子標記輔助選擇將Pi25 抗性等位基因導入恢復系恢11-32 中，選育出新恢復系R153，經稻瘟病抗性鑒定表現為抗病。在與多個不育系測配中，發現該恢復系與潢達A 配組獲得的雜交稻組合表現出較強產量雜種優勢。在2019 年中國水稻研究所組織的所內晚秈新品種比較試驗中，比對照五優308 增產11.3%，比天優華占增產4.7%。R153 的選育為雜交稻新組合選育提供了新的親本資源。

分子標記輔助選擇已成為新品種選育的常規手段，其主要優勢在于分子標記檢測與表型鑒定的吻合度高、檢測時間不受水稻種植季節限制。本研究用于檢測Pi25 的分子標記Si13070C 為緊密連鎖標記，CAP3/BglⅡ為功能標記，后者在基因型鑒定過程中需要進行酶切反應，增加了檢測成本和時間。在本研究中，我們先用連鎖標記進行初步檢測，結合基因型和表型淘汰大量個體，再對中選的少數苗頭材料用功能標記進行驗證，可有效減少工作量和試劑成本。

對于本研究的目的基因Pi25，研究表明該抗性基因在我國稻種資源中頻率較低[13]，但其對稻瘟病表現出良好抗性。本課題組近10 多年來一直圍繞該基因進行分子標記輔助選擇育種。早在2010 年，借助分子標記輔助選擇選育出攜帶Pi25 抗性等位基因的20 份候選恢復系和27 份候選保持系[9]，并將這些抗性材料提供給多家育種單位，目前已成功改良和選育出多個雜交稻親本：如以BL108 為供體親本，改良兩系不育系浙科22S，獲得5 個綜合性狀表現良好且抗稻瘟病的兩系不育系品系[14]；以BL47 為供體親本，改良三系保持系福稻B，獲得5 個候選保持系[15]；以BL27 為供體親本，改良臻達B，獲得新不育系157A[16]；以BL5 為供體親本，改良RGD-7S，獲得具有較好應用前景的兩系不育系元亨S，由該不育系配組獲得的雜交稻組合元兩優676（審定編號：閩審稻20190012）和元兩優6503（審定編號：閩審稻20200020）已通過福建省品種審定。這些品種的改良和選育均表明Pi25 具有良好的育種應用價值。

致謝：本研究所用不育系306A 和潢達A 由福建省農業科學院水稻研究所黃庭旭研究員提供，謹致謝意！