利用CRISPR/Cas9慢病毒載體構建敲除大鼠肝星狀細胞COX-2基因的細胞模型

彭 敏， 曹 婷， 陽學風， 易世杰， 傅 念， 周克兵， 龍建武

南華大學附屬南華醫(yī)院 消化內科， 湖南 衡陽 421002

肝纖維化是一系列慢性肝損傷導致的病理生理過程[1]，它是發(fā)展為肝硬化的必經(jīng)過程。目前認為，肝星狀細胞(HSC)的活化是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，因此，通過抑制HSC活化可以達到逆轉肝纖維化的目的[2]。環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)是花生四烯酸合成前列腺素的關鍵限速酶[3]，包括COX-1、COX-2和COX-3三個亞型，COX-2屬于誘導型酶。國內外大量研究[4]證明，COX-2參與肝損傷炎癥反應，促進肝纖維化發(fā)展病程，也調節(jié)HSC活化及增殖，參與進一步肝損傷。已有相關研究[5-9]報道表明，抑制COX-2表達，能夠下調HSC活化和增殖，可能成為逆轉肝纖維化的策略。目前COX-2和肝纖維化關系的研究主要集中在COX-2抑制劑或siRNA干擾技術上，至今沒有文獻報道完全敲除HSC中COX-2基因對HSC功能的影響及機制。近年來隨著CRISPR/Cas9技術的興起，使通過CRISPR/Cas9技術對COX-2基因進行敲除成為一種新的研究方向。基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)相比于RNAi技術更容易獲得穩(wěn)定的表型變化，而且具有設計簡便、易于操作及特異性高的優(yōu)勢[10]。因此本實驗通過構建慢病毒表達載體，利用CRISPR/Cas9技術敲除HSC的COX-2基因，以期獲得能穩(wěn)定傳代的COX-2基因缺陷的細胞模型，為今后研究COX-2基因缺陷的HSC功能及機制提供實驗基礎，為臨床上治療肝纖維化提供新策略。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 HSC-T6細胞購自中科院上海細胞庫，293T細胞購自南京科佰生物科技有限公司，Lenti-CAS9-puro質粒、Lenti-NC-EGFP質粒、GV371質粒、p Helper 1.0載體，p Helper 2.0載體、Primer(R&F)、dsDNA oligo、TOP10感受態(tài)均購自上海吉凱基因化學技術有限公司，Lipofectamine TM2000購自美國Invitrogen公司，基因組 DNA 抽提試劑盒購自TIANGEN公司，基因敲除和突變檢測試劑盒購自吉盛醫(yī)學公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 COX-2-sgRNA表達載體構建 (1)293T細胞培養(yǎng)：①細胞復蘇；②細胞傳代；③細胞凍存。(2)sgRNA靶點序列的選擇與合成：①靶序列選擇。根據(jù)上海吉凱基因化學技術有限公司設計3條COX-2-sgRNA干擾靶點序列，sgRNA-1：5′-AAATGTGACTGTACCCGGAC-3′；sgRNA-2：5′-CATGATTGAATTCCGAAGGA-3′；sgRNA-3：5′-TTTCACCGTAGAATCCAGTC-3′。②寡核苷酸單鏈合成：以上述靶序列為基礎，設計合成3對寡核苷酸單鏈，其兩端加入BbsI位點。(3)引物退火形成帶黏性末端的雙鏈：將引物干粉溶解于退火緩沖液中，95 ℃水浴15 min，冷卻至室溫，稀釋200倍后使用。(4)sgRNA表達載體酶切重組：通過酶切連接反應體系進行酶切連接反應，結束后將形成的重組質粒直接轉化。(5)重組質粒轉化、測序：取n支TOP10感受態(tài)，進行培養(yǎng)，待菌落長出后，挑取8個大的單克隆菌落于15 ml的液體培養(yǎng)基，送公司進行測序。(6)質粒提取：參照E.Z.N.A Endo-free plasmid mini kit試劑盒說明書標準方法制備，所得DNA溶液-20 ℃保存或直接用于下一步實驗。(7)病毒包裝：①病毒轉染；②病毒的收獲及濃縮；③病毒滴度的測定(熒光法)。使用熒光顯微鏡觀察轉染效果，圖片均使用Pixera Camera圖像分析系統(tǒng)采集。

1.2.2 CRISPR/Cas9慢病毒轉染HSC-T6細胞及活性檢測 (1)準備目的細胞：HSC-T6細胞的復蘇、傳代和凍存同前所述293T細胞的培養(yǎng)方法。(2)細胞轉染：①Lenti-Cas9-puro病毒轉染HSC-T6細胞，構建穩(wěn)定表達Cas9蛋白的HSC-T6細胞，收集細胞標記為HSC-T6-Cas9細胞，進行下一步實驗。②Real-time PCR檢測Cas9病毒轉染HSC-T6細胞后的表達情況：提取總RNA，逆轉錄獲得cDNA(按照Promega公司提供的逆轉錄試劑盒操作步驟進行)將得到的產(chǎn)物cDNA -20 ℃保存?zhèn)溆茫詈筮M行Real-time PCR，LV-Cas9-Puro基因的引物由廣州市銳博生物科技有限公司設計合成，引物序列如表1，按比例配置反應體系(12 μl體系)，反應結束后通過制作熔解曲線確認為單峰曲線，基因表達量用相對定量分析法。(3) HSC-T6-Cas9細胞的凍存、復檢：qPCR檢測結果合格后進行HSC-T6-Cas9細胞凍存，至少凍存6支，凍存2～3 d，任意復蘇1支，顯微鏡下觀察復蘇細胞狀態(tài)。(4)Lenti-COX-2-sgRNA-EGFP病毒轉染HSC-T6-Cas9細胞：①在上一步實驗的細胞基礎上，將細胞分為3組，分別為KO1組(Lenti-COX-2-sgRNA-1病毒轉染組)、KO2組(Lenti-COX-2-sgRNA-2病毒轉染組)、KO3組(Lenti-COX-2-sgRNA-3病毒轉染組)，加入相對應的Lenti-COX-2-sgRNA-1、Lenti-COX-2-sgRNA-2、Lenti-COX-2-sgRNA-3病毒進行感染。同時設立NC組(Lenti-NC病毒轉染組)、CON組(HSC-T6細胞)。②感染72 h左右，在熒光顯微鏡下觀察細胞中綠色熒光的表達狀況，估計熒光率；③分別用含1 μg/ml puromycin的培養(yǎng)液培養(yǎng)傳代細胞，得到COX-2基因敲除的HSC-T6-COX-2-/-混合細胞，分別標記為HSC-T6-COX-2-/--1細胞、HSC-T6-COX-2-/--2細胞、HSC-T6-COX-2-/--3細胞，并收集細胞做下一步檢測。(5)Lenti-NC-EGFP病毒轉染HSC-T6細胞：根據(jù)MOI值，感染Lenti-NC-EGFP病毒，在熒光顯微鏡下觀察細胞中綠色熒光的表達情況，估計熒光率，收集細胞做下一步檢測，標記為HSC-T6-NC細胞。

表1 LV-Cas9-Puro基因的引物序列

1.2.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)對COX-2靶點的敲除活性檢測 (1)混合細胞克隆pool檢測：①提取各基因組DNA；②PCR引物設計,按照引物設計通用原則，由上海吉凱公司設計合成(表2)；③按比例配置反應體系，PCR反應程序反應后獲得雜交DNA產(chǎn)物；④PCR結束后，取3 μl進行電泳檢測。(2)Cruiser酶切檢測：在滅菌PCR管中配制PCR產(chǎn)物2～3 μl、Detecase Buffer 2 μl、Detecase 1 μl、ddH2O至10 μl，45 ℃反應20 min后，立即向上述10 μl體系內加入2 μl終止液(Stop Buffer)，然后進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。(3)蛋白水平檢測：①蛋白抽提；②SDS-PAGE；③免疫印跡(濕轉)；④抗體雜交；⑤X光顯影。

表2 PCR引物序列

2 結果

2.1 COX-2-sgRNA表達載體構建 根據(jù)公司設計3條sgRNA，在其兩端加入BbsI位點，化學合成設計序列并退火形成帶有黏性末端的雙鏈，將其連接到經(jīng)BbsI限制性核酸內切酶切割形成的線性化GV371表達載體上，經(jīng)轉化擴增載體的表達，并將轉化子測序驗證。測序結果顯示，COX-2-sgRNA-1、2、3序列均成功插入目的載體，且序列完全正確。證實COX-2-sgRNA表達載體構建成功(圖1)。

注：a，COX-2-sgRNA-1; b, COX-2-sgRNA-2； c，COX-2-sgRNA-3。

2.2 病毒滴度的測定 在倒置顯微鏡及熒光顯微鏡下觀察加入病毒不同稀釋倍數(shù)的293T細胞熒光表達情況顯示，熒光細胞數(shù)量隨病毒稀釋倍數(shù)增加而減少，按照滴度計算公式：細胞數(shù)量×感染效率/感染體積，計算出COX-2-sgRNA-1的病毒滴度為8×108，COX-2-sgRNA-2、COX-2-sgRNA-3的病毒滴度為1×109(圖2)。

圖2 不同稀釋倍數(shù)COX-2-sgRNA慢病毒感染293T細胞的熒光表達情況(×100)

2.3 細胞轉染實驗

2.3.1 puromycin篩選HSC-T6-Cas9細胞 Lenti-Cas9-puro病毒為抗性基因標記，如果轉染入細胞，于感染48～72 h后，換用含puromycin的培養(yǎng)基篩選細胞，細胞存活即為陽性感染，圖3為puromycin篩選前后HSC-T6-Cas9細胞狀態(tài)及熒光表達情況。與CON組對比，篩選前后HSC-T6-Cas9細胞狀態(tài)好，未出現(xiàn)大量死亡現(xiàn)象。

注：左右分別是同一視野下光學顯微鏡圖片和熒光顯微鏡圖片。a，CON組；b，puromycin篩選前HSC-T6-Cas9細胞；c，puromycin篩選后HSC-T6-Cas9細胞。

2.3.2 Real-time PCR檢測Cas9病毒轉染HSC-T6細胞后的表達情況 收集轉染獲得的HSC-T6-Cas9細胞以及CON組細胞，分別提取LV-Cas9-Puro mRNA，利用Real-time PCR檢測獲得各組基因循環(huán)閾值，并繪制各基因在各組樣品中的相對定量直方圖。結果顯示：CON組和HSC-T6-Cas9細胞組目的基因的相對表達量分別為1.00±0.02、541.93±105.76，提示HSC-T6-Cas9細胞中LV-Cas9-Puro mRNA表達高于CON組細胞，差異具有統(tǒng)計學意義(t=12.995，P<0.01)(圖4、5)。

圖4 擴增曲線

2.3.3 HSC-T6-Cas9細胞凍存后復檢 經(jīng)Real-time PCR檢測HSC-T6-Cas9細胞中LV-Cas9-Puro mRNA表達豐度明顯高于CON組，將HSC-T6-Cas9細胞凍存2～3 d后復蘇，在顯微鏡下觀察，結果顯示：復蘇細胞狀態(tài)較好(圖6)，提示凍存細胞合格，穩(wěn)定表達Cas9蛋白的HSC-T6細胞構建成功。

圖5 熔解曲線

注：左右分別是同一視野下光學顯微鏡圖片和熒光顯微鏡圖片。

2.3.4 Lenti-COX-2-sgRNA-EGFP病毒轉染HSC-T6-Cas9細胞 COX-2-sgRNA質粒為熒光標記，如果轉染入細胞，于感染72 h 左右，熒光顯微鏡下觀察，細胞會出現(xiàn)綠色熒光。隨機選擇10個視野，計算陽性細胞與總細胞之比作為質粒轉染效率指標。圖7為各組病毒轉染72 h熒光顯微鏡圖片。KO1、KO2、KO3、NC組細胞均可見綠色熒光，轉染效率在80%以上，說明病毒轉染成功，并且puromycin對細胞無殺害作用。CON組未見綠色熒光出現(xiàn)。

注：左右分別是同一視野下光學顯微鏡圖和熒光顯微鏡圖。a，CON組;b，KO1組;c，KO2組;d，KO3組;e，NC組。

2.4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)對COX-2靶點的敲除活性檢測

2.4.1 Cruiser酶切檢測 為了研究CRISPR/Cas9系統(tǒng)對靶點的敲除作用，本實驗通過將構建好的Cas9蛋白表達載體和sgRNA表達載體轉染細胞。72 h后提取基因組，在敲除靶點上下游設計引物，通過PCR擴增出包含敲除靶點的一條目的片段，取部分行電泳檢測,利用Cruiser酶切檢測其敲除效率(圖8)。從結果可以看出，針對COX-2靶基因所設計的CRISPR/Cas9慢病毒表達載體能在靶點起作用。作用于KO1組靶點序列引物COX-2-E1-SVF/R，擴增片段長為369 bp，酶切片段長分別為120 bp、249 bp；KO2組靶點序列引物COX-2-E2-SVF/R，擴增片段長為383 bp，酶切片段長分別為251 bp、132 bp；KO3組靶點序列引物COX-2-E3-SVF/R，擴增片段長為369 bp，酶切片段長分別為123 bp、246 bp。而CON組與NC組未出現(xiàn)酶切條帶，提示無突變位點。KO1、KO2、KO3靶點有活性，且KO2活性較佳，選用KO2組進行后續(xù)蛋白水平驗證。

注：a，酶切前；b，Cruiser酶切后。

2.4.2 蛋白水平驗證 分別于轉染72 h、96 h提取CON、NC、KO組中的COX-2蛋白，利用Western-Blot檢測COX-2蛋白質表達情況。結果顯示：KO組與CON組、NC組比較，COX-2蛋白質表達明顯下調，灰度值差異具有統(tǒng)計學意義(P值均<0.01)(表3，圖9、10)。

表3 轉染72 h、96 h各組COX-2蛋白質相對表達情況

注：1,CON組；2,NC組；3，KO組。

注：1，CON組; 2，NC組; 3，KO組。

3 討論

HSC活化被普遍認為是肝纖維化發(fā)生的關鍵環(huán)節(jié)，是肝纖維化治療的重要靶點，將抗纖維化藥物靶向遞送至HSC，減少藥物非特異性作用引起的副作用，是目前抗纖維化藥物開發(fā)的重要策略[11]。同時COX-2參與調節(jié)HSC活化和增殖，參與肝纖維化發(fā)病進程。最新研究[12]表明，COX-2的結構和構象的變化可動態(tài)監(jiān)測肝病的進展，但目前COX-2和肝纖維化關系的研究主要集中在COX-2抑制劑或RNAi技術上，這些技術存在特異性不高、不能獲得穩(wěn)定傳代的細胞株等缺陷，因此需要一種高效、特異性強、穩(wěn)定的基因編輯技術，人為敲除細胞內相關基因的部分片段，從而獲得能穩(wěn)定傳代的COX-2基因缺陷的HSC進行后期的功能研究。

慢病毒以RNA為模板，先在反轉錄酶的作用下合成cDNA，再以此為模板合成雙鏈DNA，通過整合酶作用，整合在宿主細胞的染色體上，可以長期表達[13]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為第3代基因組編輯工具，與第1代鋅指核糖核酸酶和第2代轉錄激活樣效應因子核酸酶相比，該系統(tǒng)由sgRNA識別靶位點，具有低成本、簡便、精確、高效等優(yōu)勢。CRISPR/Cas9技術為各物種和多種細胞的基因組編輯開拓了選擇途徑。到目前為止，CRISPR/Cas9技術已經(jīng)成功用于小鼠、斑馬魚、酵母、擬南芥、小麥、大米以及哺乳動物細胞等。

最初人們是利用電穿孔、核轉染與脂質體的方式將Cas9和sgRNA轉入細胞內[14-16]，但利用電穿孔的方法進行轉染對細胞損傷較大，達不到理想的轉染效果。病毒載體如逆轉錄病毒載體、慢病毒載體[17]、腺病毒載體等能提高基因組編輯的效率，在體外應用比較廣泛[18]。所以本實驗采用慢病毒載體將sgRNA、Cas9導入HSC-T6細胞，構建COX-2基因敲除的HSC-T6細胞模型。本實驗成功構建了3個慢病毒載體經(jīng)測序驗證，結果顯示，COX-2-sgRNA-1、2、3序列均成功插入目的載體，且序列完全正確。證實COX-2-sgRNA表達載體構建成功。使用熒光定量法檢測出各組病毒滴度均在1×108以上。將Cas9慢病毒分別轉染至HSC-T6細胞，使用puromycin篩選、Real-time PCR檢測以及凍存后復檢，結果顯示，利用CRISPR/Cas9技術，即使不進行單克隆篩選，也能永久敲除COX-2基因，相比較RNAi而言更有優(yōu)勢。

本實驗構建了針對COX-2靶基因的CRISPR/Cas9慢病毒表達載體，成功轉染HSC-T6細胞，獲得能穩(wěn)定傳代的Cas9蛋白的HSC-T6細胞和COX-2基因缺陷的HSC-T6-COX-2-/-細胞，為后期的功能研究提供良好的工具和手段，為臨床上治療肝纖維化提供新策略。在此基礎上，本課題組會繼續(xù)研究COX-2基因敲除后HSC-T6細胞的增殖、凋亡、衰老、自噬等功能的變化，并探討其作用機制，爭取將COX-2對HSC-T6細胞作用的具體機制闡述清楚。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻聲明：彭敏、曹婷、陽學風負責課題設計，資料分析，撰寫論文；易世杰、周克兵、龍建武參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；傅念、陽學風負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。