循環microRNA作為肝細胞癌標志物的研究現狀

謝惠君， Rashed Nasot， 寧 勇， 高 川

湖北中醫藥大學 檢驗學院， 武漢 430065

1 肝細胞癌(HCC)的發生和發展伴隨著microRNA(miRNA)的異常表達

HCC是最主要的原發性肝癌，也是致死率最高的癌癥之一, 僅美國在2020年就預期約有30 000人死于HCC[1]。當前對HCC的臨床診斷除了依靠有限的血清標志物，例如甲胎蛋白、甲胎蛋白異質體以及異常凝血酶原之外，還需要比較先進的影像學技術的支持[2]。而大多數HCC患者被確診時已經處于晚期，可供選擇的治療手段有限[3]。更加全面的了解有關HCC發生的分子機制以開發出可用于早期診斷的方法是當前迫切的需求。

miRNA是一類內源性、不編碼蛋白質的小RNA。成熟的miRNA能引導RNA誘導沉默復合體作用于靶標mRNA的3′-非翻譯區，繼而影響其穩定性和翻譯成蛋白質的效率，最終“沉默”靶基因的表達[4]。miRNA對靶標的識別是通過位于其5′- 端、長度僅為6～8個核苷酸的種子(seed)序列，這使得單一miRNA能作用于多個靶標，而已發現的超過2000個人類miRNAs將能廣泛的調節基因表達[5]。與mRNA不同，miRNA在循環血中非常穩定，這是因為分泌到胞外的miRNA大多都包裹在外泌體、微囊泡之內或者處于與蛋白質(AGO2，高密度脂蛋白等)結合的復合體形式從而能抵抗RNase的降解[6-7]。miRNA的這些性質使它們有希望成為用于臨床檢驗的生物標志物。

肝臟維持正常的生理功能需要miRNA。在胚胎期敲除了肝細胞中的Dicer1從而整體擾亂miRNA成熟過程的小鼠在2～4月齡時出現了嚴重的肝損傷[8]。在成年小鼠其肝細胞中敲除Dicer1的初期也會產生類似的表現型，部分能長期存活的小鼠其肝組織主要由僥幸逃過Dicer1敲除的肝細胞構成，它們中大多數在1年內發展成源自殘留的Dicer1-/-肝細胞的HCC[9]。miR-122是肝臟中含量最豐富的miRNA[10]，具有維持肝臟自穩(homeostasis)的作用[11]。利用反義核苷酸部分阻斷內源性miR-122會顯著降低小鼠體內甘油三酯和膽固醇的水平[12]，強制過表達miR-122則能緩解模型小鼠肝臟中因輸血性鐵過剩引發的炎癥反應[13]。

miRNA廣泛參與HCC的發生和發展[14]。通過比較源自臨床HCC樣本的癌和癌旁組織中的miRNA表達譜已經發現了一系列差異表達的miRNAs，包括在HCC中常常低表達的miR-122、miR-199a、miR-133b、miR-200等以及在HCC中高表達的miR-18、miR-21、miR-221和miR-769等[15-20]。一般而言，在HCC中異常低表達的miRNA有抑癌作用，例如：miR-122可以通過調節M2型丙酮酸激酶來影響HCC細胞中的葡萄糖代謝[21]，亦可通過調節cyclin G1而抑制HCC細胞的周期[22]，還可以通過調節轉化蛋白RhoA來阻礙HCC的侵襲和轉移[23]。miR-199a和miR-122一樣在HCC細胞代謝葡萄糖的過程中起著重要的作用。過表達miR-199a-5p可以降低M2型丙酮酸激酶以及HK2的表達從而抑制HCC細胞的生長[24-25]，而miR-199a-3p則可抑制對HCC增殖起促進作用的PAK4/Raf/MEK/ERK、mTOR以及c-MET通路[26-27]。與miR-122及miR-199a相比，miR-133b在正常肝細胞中的表達不算豐富，而在HCC臨床樣本中的表達普遍更低[18,28]。在HCC細胞系中的研究表明miR-133b能通過調低SH3蛋白1和SF3B4來抑制癌細胞的生長和侵襲。在HCC中異常高表達的miRNA往往有促癌作用。例如，miR-221在包括HCC在內的許多癌組織中都被發現表達上調[29]，它調節的靶標有許多是涉及癌細胞增殖和侵襲的關鍵基因，包括CDNN1B(p27)、CDKN1C(p57)、mTOR以及抑癌基因PTEN和TIMP3等[29-31]。最近的研究[32]還發現miR-221可靶向調節Caspase-3來抑制細胞凋亡，它的高表達在HCC動物模型和臨床樣本中都與癌細胞對Sorafennib的耐藥性呈正相關。無論是抑癌還是促癌的miRNA都有可能成為HCC的治療靶點和臨床診斷標志物。

2 循環miRNA應用于HCC臨床檢驗和診斷所面臨的問題

鑒于miRNA在循環血中的穩定性以及在功能上與HCC之間存在的相關性，許多團隊嘗試對循環miRNA進行深度測序以探索它們作為HCC診斷標志物的潛能。Li等[33]于2010年發現在HBV感染陽性的患者中可以通過聯合檢測miR-25、miR-375和let-7f來區分HCC患者和對照者(特異度為96%，敏感度為100%)；隨后，Zhou等[34]所進行的類似研究中發現聯合檢測miR-122、miR-192、miR-21、miR-223、miR-26a、miR-27a和miR-801可以用來診斷HCC。Lin等[35]提出了使用由miR-29a/c、miR-133a、miR-143、miR-145、miR-192和miR-505等7個miRNAs組成的Cmi(miRNA classifier)用于檢測HCC，并發現其準確性優于單獨依賴腫瘤標志物甲胎蛋白。還有一些學者聯合使用了循環miRNA和現有的HCC臨床診斷標志物。例如：El-Abd等[36]發現血清miR-199a和miR-16水平與HCC的腫瘤結節大小和數量等指標顯著相關，聯合檢測血清miR-16與甲胎蛋白可以更好地區分慢性HCV相關的HCC(特異度為87.5%，敏感度為85%)。Nomair等[37]嘗試聯合檢測血清中的miRNA-224與甲胎蛋白來診斷HCC，也得到了類似的結果。這些研究為后續尋找新的用于檢測HCC的臨床標志物奠定了基礎，但是必須認識到要在臨床實踐中應用miRNA作為HCC的標志物還有很多問題亟待解決。

對臨床血樣中的miRNA測序后的組學數據進行統計學分析屬于相關性研究而非功能性研究，從中得到的可能作為HCC標志物的miRNA與HCC的生物學關系需要明確，這一工作困難重重。首先，要確定血樣miRNA的組織來源非常困難。不同于mRNA，miRNA的表達鮮有組織特異性，而在正常肝細胞中高表達的miRNA僅有miR-122、miR-92和miR-199a等少數幾種，其他絕大多數miRNAs都處于極低的基礎表達狀態(<10 TPM, transcripts per million)[27,38]。通過取樣的方式確定血樣中過表達的miRNA的組織來源在臨床上很難實現。此外，即便確定了miRNA的組織來源也并不意味著找到了研究對象。許多成簇(cluster)表達的miRNA由共同的初級轉錄本(pri-miRNA)編碼，進行功能研究時，需要考慮這些簇成員的選擇性胞外輸出特性和在成熟過程當中以及對靶標基因調節方面的協同作用[39-40]。而研究由mirtron編碼的miRNA時，還需要顧及這些miRNAs與包含它們的基因在功能上可能形成的反饋回路[41-42]。此外，被其他組織釋放到胞外的miRNA經過血液循環運送到肝臟從而“遠程”發揮作用的可能性也不能排除[43-44]。綜合這些考量，鑒定循環血中發現的HCC相關miRNA的功能任重而道遠。

使用循環miRNA作為生物標志物還面臨一些技術層面的問題。從血清、血漿和其他多種體液中提取miRNA并進行分析早有先例[45]，然而還難以做到對循環miRNA水平的公允評估[46]。首先，尚未發現可靠的內參miRNA可以用來比較不同樣本中的循環miRNA的表達水平[47-49]，使用其他內源性小RNAs(例如U6)作為替代或者引入外參(例如cel-miR-39)的效果還存在爭議[50]。其次，在用臨床血樣制備血漿或血清的流程中，包括取血時對抗凝劑的選擇(例如肝素或EDTA)、樣本處理時離心條件的設定等均會影響到所取得的miRNA組(miRNome)的成分。另外，在執行深度測序之前的一些步驟，比如RNA接頭連接、逆轉錄、擴增等酶學反應，在應用于miRNA研究時常常會表現出依賴于堿基序列的偏差。在當前的技術條件下，從循環血中提取和檢測miRNA需盡可能使用一致、簡單和快速的方法并且做到批量處理樣本以減少系統誤差，而今后的方法學應該關注對miRNA樣本在不進行復雜擴增的情況下進行有效的檢測[51-52]。

3 總結和展望

HCC因其高死亡率和不良預后已經成為世界各國面臨的嚴重的健康問題，早期診斷、持續監測和新療法的開發是HCC臨床管理的重要內容。目前臨床對HCC診斷常依靠血清標志物甲胎蛋白和影像學檢查，但是一方面，早期HCC患者甲胎蛋白指標的假陰性率約40%[53]，而影像學檢查受腫瘤大小等因素的影響常常不易區分肝臟良性病變與HCC。另一方面，從受檢者的感受考慮，創傷性的組織活檢不適合作為早期診斷和持續監測的檢查項目。miRNA的異常表達是HCC中的常見現象，因此可以成為開發檢測方法和藥物的依據。現有研究支持將血液中一些循環miRNA開發成為HCC的臨床診斷標志物，聯合檢測多種miRNAs或者miRNA與甲胎蛋白聯合來診斷HCC在實驗中獲得了較高的準確度和敏感度。目前仍需要進一步深入研究miRNA與HCC分子機制之間的關系和解決一些臨床應用層面的關鍵問題，例如開發更加便利的針對循環miRNA的提取技術和不依賴核酸擴增的檢測技術等，為循環miRNA在臨床檢驗和診斷中的應用提供更加穩固的理論基礎和技術支持。

作者貢獻聲明：高川、寧勇負責課題設計；謝惠君、Rashed Nasot、高川撰寫論文初稿；Rashed Nasot、寧勇參與收集數據和修改論文；寧勇指導撰寫文章；高川、寧勇最后定稿。