腫瘤相關成纖維細胞與肝癌的關系

胡 曉， 毛德文， 牙程玉

1 廣西中醫藥大學 研究生學院， 南寧 530001； 2 廣西中醫藥大學第一附屬醫院 肝病一區， 南寧 530023

原發性肝癌(簡稱肝癌)是一種惡性程度極高的腫瘤，其死亡率在我國乃至全世界的惡性腫瘤中位居前列。依據組織病理學可將肝癌分成3大類型：肝細胞癌(HCC)、膽管細胞癌(ICC)和混合型肝癌，其中HCC占比高達90%[1]。肝癌具有隱匿起病，進展迅速，治療難度大的特點。鑒于肝癌對化療并不敏感，目前臨床多采用放療、消融術、經肝動脈化療栓塞術(TACE)、肝移植、手術切除等治療方案，但治療效果也往往不及預期。近年來，廣大學者對各種癌癥發生發展機制有了更新的認識，提出腫瘤微環境的概念[2]，認為腫瘤微環境有望為癌癥治療提供全新的靶位。腫瘤微環境包括數量眾多的存在于腫瘤周圍的細胞(間質細胞、免疫細胞以及內皮細胞等)，其中，隸屬于間質細胞的腫瘤相關成纖維細胞(cancer associated fibroblasts，CAF)占重要地位[3-4]。CAF存在于腫瘤間質中，由多種細胞分化而來，目前多數認為成纖維細胞(normal fibrolasts，NF)是其主要來源[5]，CAF的致癌作用已得到證實。在肝癌中，CAF通過激活各種途徑(信號通路)、啟動多種細胞因子表達參與肝癌細胞之間的串擾，干擾正常組織細胞之間的生存秩序，進而為腫瘤細胞提供適合生存發展的微環境[6]。越來越多的證據顯示，CAF既可發揮促進腫瘤細胞形成、血管生成、侵襲轉移的作用，又可能起到抑制腫瘤演變的積極影響。

1 CAF與肝癌的發生發展

1.1 CAF在肝癌生成和增殖中的作用 CAF可通過分泌多種促腫瘤形成的關鍵細胞因子(生長因子、炎性因子和趨化因子等)，以啟動相關信號轉導通路直接或間接對腫瘤的生成和增殖起作用。馮仁鑫等[7]在研究CAF對肝癌干細胞的作用時觀察到，經CAF培養的腫瘤干細胞相較于對照組，其自我更新相關基因Oct4、Nanog、Klf4、Bmi1的表達上調明顯，干細胞成球能力顯著增高，由此可見，CAF可通過影響腫瘤干細胞的更新促成HCC。Li等[8]的實驗也證實CAF釋放肝細胞生長因子和IL-6細胞因子以激活STAT3磷酸化來增強了CD24+HCC細胞的干性，促進其成癌性。沙朦等[9]的CCK8實驗發現人肝內膽管癌相關成纖維細胞培養基(iCAF-CM)中的膽管癌RBE細胞和HCC C9810細胞吸光度值均明顯高于對照組, 證明肝內膽管癌細胞的增殖能力被iCAF提升。孫浩然等[10]探究了CAF與肝癌細胞株Huh7、HepG2之間的關系，結果在建立的體外CAF-Huh7和CAF-HepG2培養模型中檢測到兩種癌細胞株增殖能力的提升。Lau等[11]將源自HCC患者的癌細胞與CAF 1∶1混合異體種植到小鼠體內開展體內致瘤性實驗，與單獨癌細胞注射組相比，實驗組表現出更強大的致癌潛力。并且發現CAF產生大量肝細胞生長因子，以c-Met/FRA1/HEY1為媒介，豐富肝腫瘤起始細胞(T-IC)的數量并對其進行調控。Deng等[12]的研究中，肝腫瘤相關成纖維細胞利用IL-6介導的STAT3，誘導從基質細胞衍生因子(stromal cell-derived Faceor，SDF)-1a/CXCR4途徑吸引來的單核細胞分化為髓源性抑制細胞，由于髓源性抑制細胞的激活，人體抗腫瘤免疫反應減弱，促成了肝癌的發生。

1.2 CAF在肝癌血管生成、血管生成擬態中的作用 由于肝癌是高度血管化的實體瘤，所以針對其血管的研究顯得尤為必要。研究表明，CAF通過釋放促血管生成因子起到促進腫瘤新生血管形成的作用。Liu等[13]對63例HCC患者的腫瘤組織進行檢測，發現血管內皮生長因子成員之一的胎盤生長因子(placental growth factor，PlGF)，在CAF和活化的肝星狀細胞中高表達，而過度表達的PlGF又同腫瘤新生血管標志物(CD31、CD34和CD105)高度相關，由此分析CAF可分泌PlGF，這對肝細胞癌血管新生起到促進作用，并可能導致HCC患者的預后不良。Huang等[14]通過與非CAF組對照比較，研究CAF促進人臍靜脈內皮細胞增殖和血管生成的機制，結果表明CAF可通過體內外血管內皮生長因子的分泌上調人臍靜脈內皮細胞中zeste同系物2的增強子的水平，從而阻止血管抑制素1的表達，最終對人臍靜脈內皮細胞的增殖和血管形成起作用，進一步證明了CAF在肝癌血管形成中的影響。盧逸等[15]和李艷等[16]的試驗中，對20例、56例HCC患者肝癌組織及癌旁組織中的肝癌相關成纖維細胞(hCAF)和微血管密度(microvascular density，MVD)進行研究，在接近血管內皮細胞位置的癌血竇周圍發現hCAF標志物α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的高表達，并在低分化肝癌組織中檢測到明顯高于中、高分化癌組織的hCAF密度和MVD，表明越高表達的hCAF，越高的腫瘤MVD，分析hCAF可能在腫瘤血管新生中起促進作用。

血管生成擬態(vasculogenic mimicry，VM)，有別于傳統的血管生成模式，已被證實普遍存在于各種腫瘤中，腫瘤細胞在早期生長階段可由這個通道獲得豐富的血液灌注和營養，VM可成為腫瘤細胞侵襲轉移的路徑，并作為影響癌癥預后的危險因素，與患者的生存率密切相關[17-18]。陶明珠等[19]檢測了60例HCC患者的癌組織標本，對患者的 CAF表達率、VM表達水平進行分析，結果顯示α-SMA+CAF的高表達和VM的形成同腫瘤的大小、Edmondson分級、臨床分期有關聯，證實了CAF通過某些機制參與促進了肝癌VM的形成，并推斷兩者之間存在正相關性。Yang等[20]通過向小鼠體內注射人HCC QGY-7703腫瘤細胞和CAF建立異體種植模型以研究CAF與VM形成之間的關系。在這項研究中，發現CAF的分泌因子TGFβ和SDF1通過提高腫瘤細胞中血管內皮-鈣黏著蛋白，基質金屬蛋白酶2和層粘連蛋白γ2的表達水平，促成了VM。進一步的研究發現，將miR-101注射至小鼠模型體內后，可阻斷TGFβ和SDF1的信號通路，從而對CAF促VM的形成起到阻抑作用，或可為抗腫瘤提供新的思路。

1.3 CAF在肝癌轉移侵襲中的作用 肝癌極易發生轉移，且轉移部位廣泛，可大致分為肝內轉移和肝外轉移。肝內轉移多為癌細胞直接侵犯或癌栓脫落形成病灶，肝外轉移則包括血行、淋巴及種植轉移，轉移灶可達全身多處器官和組織。研究者們認為，被活化的CAF在腫瘤轉移的過程中舉足輕重，因此進行了大量的試驗進行驗證。華學鋒等[21]觀察了與hCAF體外共培養的肝癌細胞在96 h后的形態變化，結果發現MHCC97L-GFP肝癌細胞出現了播散樣生長的變化，而HepG2-GFP肝癌細胞則發生了上皮細胞間質轉型，由此得出hCAF能增強肝癌細胞轉移侵襲的結論。在Fang等[22]的研究中發現CAF受到腫瘤細胞釋放的外泌體miR-1247-3p的誘導而被活化，并且在伴有肺轉移的HCC患者血清中檢測到高于非肺轉移HCC患者的miR-1247-3p表達水平，由此判斷CAF在該外泌體的作用下與肝癌細胞之間發生串擾，與肝癌的肺轉移密切相關，并分析這種相同的作用機制很可能也發生在肝癌的肝內轉移中。Zhang等[23]分別對裸鼠靜脈注射熒光素酶標記的MHCC97-H-miR-320a和MHCC97-H-NC細胞，28 d后，前者的6只小鼠中僅4只發生肺轉移，而接受MHCC97-H-NC細胞注射的小鼠均出現肺轉移，并對來源于人HCC的CAF外泌體進行測序，觀察到CAF外泌體miR-320a較癌旁成纖維細胞表達有降低，分析源于CAF的外泌體miR-320a在CAF與腫瘤細胞之間充當“使者”，miR-320a的表達抑制促成HCC的轉移。Sha等[24]從ICC患者的腫瘤細胞中分離出CAF、NF，并將ICC細胞HuCCT-1接種于條件培養基(CAF-CM、NF-CM)上，通過細胞數量計數發現侵襲性ICC細胞在CAF-CM中表現出更強大的侵襲轉移能力。同時還證實α-SMA表達的CAF與ICC的淋巴結轉移相關，Zhang等[25]的研究也佐證了CAF組織學表型中的未成熟表型與ICC的淋巴結轉移緊密相關。武偉等[26]探討了CAF與膽管癌細胞株RBE之間的關系，同樣證實了CAF與膽管癌細胞增殖侵襲之間的正相關性，且發現CAF并不參與膽管癌細胞的凋亡。為評估CAF在體內外與HCC轉移的關系，Liu 等[27]進行小鼠體內實驗，觀察到接種了肝癌細胞和CAF的小鼠(7/8)在腦、骨骼或肺中均出現HCC轉移，轉移率遠遠高于對照組；在體外CM試驗中得出HCC細胞中Hh和TGFβ途徑受到CAF分泌的CCL2、CCL5、CCL7和CXCL16趨化因子的激活而促成HCC轉移的結論。

2 CAF在肝癌治療中的潛力

肝癌極高的惡性程度、進展速度和復發概率導致了患者的高病死率，增加了其治療難度，現有的治療方案遠不足以解決這一難題。近幾年，科學家們開始認識到靶向調節CAF或可成為抗衡腫瘤有前途的治療策略。Sun等[28]為了研究CAF衍生的旁分泌COMP是否受Resolvin D1的調節而對HCC干細胞起作用，利用補充COMP中和抗體的CAF-CM處理肝癌Hep3B和SMMC-7721細胞，結果發現，COMP中和抗體減弱了CMCAF誘導的上皮細胞間質轉型進展和侵襲能力，并降低腫瘤細胞的增殖能力，證實RvD1可阻礙CAF的旁分泌COMP信號傳導，對癌細胞的干性特征起到抑制作用。有學者[29]提出，CAF可通過誘導癌細胞的自噬，促進放射治療后癌細胞修復，引起腫瘤復發，因此阻斷癌細胞的自噬作用可能是克服腫瘤復發的新策略。Zhao等[30]對實驗組CAF-CM組和對照組NF-CM組培養的肝癌Huh7細胞進行免疫熒光染色、蛋白質印跡檢測，觀察到CAF-CM組較對照組的Huh7細胞有更高的自噬水平，并采用自噬溶酶體抑制劑氯喹(CQ)對Huh7細胞進行處理，發現即使是經過CAF-CM共培養的癌細胞，其自噬作用也可被CQ有效抑制，并且表現出侵襲、轉移能力的下降。有研究[31]表明，CAF的激活是可逆轉的，Mertens等[32]的實驗也證實了這一點，利用Navitoclax對CAA異體細胞移植大鼠模型進行治療，研究治療后大鼠肝臟，發現α-SMA表達減少，平均腫瘤-肝臟質量比降低，腹膜轉移也有所減少，由此得出CAF可在Navitoclax的誘導下發生凋亡，足以在減小腫瘤大小、抑制轉移方面起積極作用。Yu等[33]在對肝癌動物模型進行研究時提出，CAF在肝癌進程中可發揮免疫作用，可增加T淋巴細胞等免疫細胞的功能，在HCC中起有效促瘤作用，由此認為清除CAF或可增強肝細胞的抗腫瘤免疫力。

3 總結與展望

綜上所述，CAF作為腫瘤周圍細胞中的第二大類細胞，通過各種途徑協同參與腫瘤細胞的增殖、侵襲轉移及抗凋亡，在腫瘤微環境中所起的作用越來越突出。近年來，針對腫瘤微環境中各個組成部分的治療策略備受矚目，并取得了一定的成果，尤其是CAF相關的免疫療法、靶向治療等，成為對抗克服腫瘤的潛在診斷、治療方案，但仍有許多不足亟待解決：(1)CAF來源的多樣性決定了其異質性，甚至不同階段的CAF在表型和功能上也呈現出差異，由此產生的差異在腫瘤的發生演變中或可起到不同的作用，因此如何精準確定CAF的來源和亞型，并采用相對應的CAF靶向藥物對腫瘤進行精準干預是目前面臨的難題[34]。(2)活化的CAF的促瘤性已得到證實，現發現CAF的活化與炎癥、自噬等密切相關，為探尋更有效的抗腫瘤靶位，有待進一步深入研究CAF活化的病理機制，以及其同腫瘤細胞之間相互作用的分子機制[35]。(3)當前針對CAF的研究多數停留在體外實驗或者動物實驗，且研究數量有限，一方面，還需考量能否在人體內發揮相似的作用機制;另一方面，CAF靶向治療相關藥物的安全性尚不明確，還需開展更多的臨床研究加以佐證。

作者貢獻聲明：胡曉負責擬定寫作思路，撰寫文章并最后定稿；毛德文教授負責對文章的知識性內容做批判性審閱；牙程玉參與文章修訂。