miR-152-3p靶蛋白差異表達及調控機制在肝癌復發中的作用

劉晨霞， 常 凱， 那琬琳， 王艷艷， 牟 東， 李 華， 江忠勇， 劉 媛， 熊 杰

1 西南醫科大學 臨床醫學院， 四川 瀘州 646000； 2 西部戰區總醫院 a.檢驗科， b.消化科， c.腫瘤科， 成都 610083

1 材料與方法

1.1 樣本收集 收集2010年—2017年西部戰區總醫院HCC切除術后5年預后良好肝癌組織(n=6)和手術后2年內復發患者的肝癌組織(n=6)?；颊吲懦悄虿?、冠心病、高血脂、高血壓、腎病和自身免疫性疾病。患者第1次肝癌切除術中肝癌組織置于保護液放入液氮中保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白質提取 將待測樣品置于裂解緩沖液中，冰浴超聲勻漿器處理，收集上清液備用[8]。

1.2.2 蛋白質消化和TMT標記 使用Thermo Scientific 的BCA蛋白測定試劑盒及TMT蛋白標記試劑盒，根據說明書消化酶切標記合成肽混合物于室溫2 h，標記好的樣本進行真空干燥備用。

1.2.3 HPLC-MS/MS分析 在緩沖液(20 mmol/L甲酸銨水溶液)中溶解肽混合物，Ultimate 3000高效液相系統(Thermo Fisher scientific, MA, USA)進行分離。流動相為5%～45%線性梯度，20 mmol/L甲酸鈉(溶劑：80%乙腈)，流速1 ml/min，分離12個餾分。

肽段分餾組分用含0.1%甲酸的超純水分別溶解，10 μl樣品上樣過色譜柱(Thermo Scientific Acclaim PepMap C18, 100 μm×2 cm)，流速10 μl/min。隨后線性梯度2%～40% D液(含0.1%甲酸的乙腈)分別經分析柱(Acclaim PepMap C18, 75 μm×15 cm)70 min，流速300 nl/min。

1.2.4 靶基因分析 在數據庫miRbase和NCBI中收集各物種已知成熟的has-miR-152-3p序列，應用VectorNTI對該序列在各物種之間進行同源性分析[9]。采用TargetScan、picTar、microT、PITA、miRmap和miRanda 6個在線數據庫預測has-miR-152-3p的靶基因及轉錄因子。

1.2.5 生物信息學分析 采用Gene Ontology(GO)和DAVID數據庫對has-miR-152-3p預測的靶基因集合進行富集分析和基于REACTOME數據庫的信號轉導通路富集分析。應用GAD disease和OMIM disease兩個疾病數據庫進行疾病富集；應用CGAP EST QUARTILE進行組織富集分析；應用BIOGRID INTERACTION進行蛋白互作分析。以P<0.05為顯著性閾值，得到基因集合相對于背景具有統計學意義的信號轉導和疾病通路[10]。

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1.2.6 突變率分析及生存曲線分析 應用TCAG數據庫和GDC數據庫，采用群組分析研究方法調取與肝臟組織有關目的基因的所有基因突變和生存率分析相關數據10 202例，以AKAP1、FOXRED1、MRPL28、MRPL50、SHC1、STAU1基因為篩選條件，共發現有關研究項目153例。逐一下載相關研究序列信息，分析其單群組單基因生存曲線、突變類型和突變頻率；再分析多群組多基因聯合的生存曲線、突變類型和突變頻率。

1.3 倫理學審查 本研究方案經由西部戰區總醫院倫理委員會審批，所納入患者均簽署知情同意書。

2 結果

2.1 靶基因預測與GO分析 應用TargetScan、picTar、PITA、miRmap、microT和miRanda 6個數據庫抓取的靶基因分別為655、413、2522、1304、1128和1035個。應用媒介嚴格控制方法(CLIP數據≥2)篩選得到3714個靶基因。

將>2個數據庫預測得到的3174個候選靶基因進行GO分析，發現miR-152-3p的靶基因主要富集在核質、細胞質和細胞溶質等區域(P<0.01)。分子功能主要富集在蛋白結合、ATP結合、細胞黏附等分子功能中(P<0.01)。涉及細胞間黏著、細胞周期停滯、細胞黏附調節等主要生物學進程(P<0.01)(表1)。將GO富集分析后的生物學對應事件進行比例分析如圖1[11]。

注：a，GO生物學進程分布圖；b，GO分子功能分布圖；c，GO細胞成分分布圖。

2.2 TMT標記定量蛋白質組學檢測與分析 應用RT-PCR檢測經HCC切除術后5年預后良好和手術后2年內復發患者肝癌組織的miR-152-3p表達水平。RT-PCR檢測表明肝癌復發組的miR-152-3p相對表達量(0.047±0.022)明顯低于預后良好組(0.231±0.154，t=5.973，P<0.001)。應用TMT技術標記肝癌組織后經LC-MS/MS檢測分析獲得肽段42 029個，結合miR-152-3p候選靶基因分析得到顯著性差異表達蛋白質17個，其中ROBO1、MCM3、MET、MRPL28、SHC1、TMTC3、STAU1、FOXRED1、MMS19、BCCIP、MTMR12、AKAP1、MRPL50在術后復發組中蛋白質表達量降低；而CAP1、HLA-C、RTN4、SLC44A2蛋白質表達量升高(P值均<0.05)(圖2)。

圖2 TMT全蛋白組學定量檢測分析miR-152-3p靶蛋白質的表達差異

2.3 靶基因GO富集分析 將TMT蛋白測序得到的17個受miR-152-3p調控的靶基因進行GO分析，發現靶基因主要富集在線粒體和質膜區域。分子功能主要富集在Poly(A)RNA結合和蛋白質結合等分子功能中。涉及線粒體翻譯延伸/終止和信號轉導兩大生物學進程(表1)。

表1 miR-152-3p靶蛋白的GO富集分析結果

2.4 靶基因的相關代謝通路富集分析 基于REACTOME pathway方法對miR-152-3p靶基因進行富集分析。ROBO1和CAP基因參與Slit/Robo信號通路；MRPL28和MRPL50參與線粒體翻譯的起始、終止和延伸途徑。信號通路均與癌癥復發機制關系密切(表2)。

表2 miR-152-3p靶蛋白的相關信號通路富集分析結果

2.5 靶基因的相關疾病富集分析 基于GAD disease和OMIM disease兩個疾病數據庫，對miR-152-3p靶基因進行富集分析[12]。結果顯示蛋白質定量性狀位點富集分值最高；其次為獲得性免疫缺陷綜合征、頭頸癌和乳腺癌(表3)。

表3 miR-152-3p靶基因的相關疾病富集分析結果

2.6 靶基因的組織定位富集分析 SHC1、BCCIP、TMTC3、MCM3、AKAP1 5個基因富集在正常胎盤組織中；ROBO1、SLC44A2等基因富集在正常結腸組織；CAP1、HLA-C等基因富集在正常脾組織中(表4)。然而正常胎盤組織表達的基因在肝癌組織中出現，說明SHC1、BCCIP、TMTC3、MCM3、AKAP1基因具有促進激活細胞增殖、分裂等能力，與腫瘤的增殖復發關系密切。

表4 miR-152-3p靶蛋白的組織定位富集分析結果

2.7 靶基因的多重富集分析及驗證 多重富集分析發現miR-152-3p靶基因主要作用于肝癌細胞的線粒體呼吸鏈，參與蛋白為AKAP1、FOXRED1、MRPL28、MRPL50、SHC1、STAU1，其可能的調控模式如圖3。

圖3 miR-152-3p靶蛋白參與呼吸鏈調控的預測途徑

基因突變及突變后生存曲線分析結果表明：上述蛋白的功能缺失或減弱會嚴重影響患者的預后生存率。SHC1和AKAP1的體細胞突變頻率較高，均為3.33%，STAU1在該組隊研究中未發現體細胞突變。SHC1和AKAP1發生拷貝數變異增加的頻率也相對較高，分別為48.68%和17.11%。發生拷貝數變異減少頻率較高的基因是FOXRED1，為16.45%(表5)。臨床生存率分析研究表明：SHC1基因突變后的5年生存率為22%，線粒體呼吸鏈相關6個基因多群組研究分析其5年生存率為41%。無論單基因群組研究，還是多基因群組分析均表明，線粒體呼吸鏈相關的6個基因功能發生改變時均會嚴重影響生存率(圖4)。

圖4 miR-152-3p作用于線粒體呼吸鏈相關基因的突變率及生存曲線分析

表5 miR-152-3p作用于線粒體呼吸鏈相關基因的突變頻率統計表

3 討論

已有研究發現miR-152-3p在HCC中的表達程度較低，表明miR-152-3p可能在肝癌的發生和進展中具有抑制腫瘤的能力[12-13]。Dang等[14]發現miR-152-3p的下調程度與HCC的臨床分期有關。晚期Ⅲ、Ⅳ期患者miR-152-3p表達明顯低于Ⅰ、Ⅱ期(P值均<0.05)。腫瘤體積越大，miR-152-3p的表達越低，表現為腫瘤的生長和惡化[15]。因此，已有的研究結果揭示了miR-152-3p與肝癌進展的關系緊密，檢測miR-152-3p的表達對臨床預測HCC的進展和預后具有重要價值，然而其具體的調控機制、信號通路及作用位點并不明確。

該研究中發現miR-152-3p靶基因主要作用在線體呼吸鏈中，參與調控的靶蛋白AKAP1、FOXRED1、MRPL28、MRPL50、SHC1、STAU1在肝癌復發組中均不同程度降低。但已有研究表明在腫瘤分化與增殖過程中線粒體呼吸鏈的活躍程度增高，上述6個呼吸鏈相關蛋白在肝癌組織中的表達量均高于癌旁組織。腫瘤干細胞是腫瘤細胞中存在的小部分具有無限自我更新和多向分化潛能的細胞亞群，是腫瘤復發、惡性轉移的細胞學根源。腫瘤干細胞時刻維持較低的細胞氧化代謝水平，待到時機成熟進行大量的增殖分化。因此，筆者認為在肝癌復發組中呼吸鏈相關蛋白表達量較低從某種程度上反映了腫瘤干細胞的比例較高，肝癌復發的可能性較大。

在受miR-152-3p調控的靶蛋白中，FOXRED1作為呼吸鏈NADH脫氫酶的裝配因子，可調節呼吸鏈復合體Ⅰ的功能，進而影響包括誘導腫瘤發生和mtDNA突變所致的損傷[16]；AKAP1是重要的線粒體調節蛋白，對線粒體氧化呼吸和活性氧自由基的生成有增強作用[17]；MRPLs(MRPL50/L28)是合成線粒體核糖體大亞基的成員，影響下游線粒體蛋白的翻譯和呼吸鏈復合體的合成[18]。SHC1和STAU1可與HSP70相互作用抑制凋亡誘導因子(apoptosis-inducing factor，AIF)從線粒體的釋放，AIF作為雙功能蛋白酶，具有氧化還原活性和促進凋亡活性[19]。AIF作為氧化還原酶，是呼吸鏈復合體的直接構成元件，還是僅影響呼吸鏈復合體 Ⅰ 的組裝及其穩定性仍有待進一步研究[20]。這6個蛋白與線粒體呼吸鏈的結構構成、氧化分解和能量釋放直接相關，是肝癌細胞線粒體氧化呼吸的重要調控因子。本研究中分析的基因突變率和生存曲線也反映出這6個基因對細胞及生物個體的影響。

綜上，miR-152-3p主要通過調控靶基因AKAP1、FOXRED1、MRPL28、MRPL50、SHC1、STAU1作用于線粒體呼吸鏈，影響細胞氧化呼吸功能導致HCC復發。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻聲明：劉晨霞、常凱、江忠勇負責課題設計、資料分析、撰寫論文；那琬琳、王艷艷、牟東、李華參與收集數據、修改論文；劉媛、熊杰負責擬定寫作思路、指導撰寫文章并最后定稿。