輔助性T淋巴細胞17/調節性T淋巴細胞比值失衡在HBV相關肝臟疾病進展中的作用

唐光俊, 游 晶, 劉懷鄂, 彭玉娟

昆明醫科大學第一附屬醫院 感染性疾病和肝病科， 昆明 650032

HBV感染至今仍呈世界性流行，慢性乙型肝炎(CHB)是當今最嚴重的世界性傳染病之一，極大影響公眾健康及加重衛生系統負擔。感染HBV后，若患者自身免疫力不足以清除病毒，可發展為CHB。HBV持續大量復制，肝臟長期處于慢性炎癥狀態，在免疫系統作用下可進一步發展為肝硬化、肝細胞癌(HCC)等嚴重疾病。 輔助性T淋巴細胞17(Th17)與調節性T淋巴細胞(Treg)失衡所引起的免疫系統調節失衡在CHB病情進展中扮演著重要角色，了解該失衡機制及過程對于疾病認識、治療及延緩病情進展具有重要意義。

1 Th17與Treg

Th17是Harrington等[1]于2005年在小鼠體內發現的一種由CD4+T淋巴細胞分化出的新型輔助性Th亞群，視黃酸受體相關的孤兒受體γt(orphan nuclear receptor, RORγt)為標志性轉錄因子[2-3]。在TGFβ的存在下及IL-6、IL-23協同下，通過JAK/STAT、NF-ΚB/MAPK等多條信號途徑由CD4+T淋巴細胞分化而成[4-5]。

Treg是Sakaguchi等[6]于1995年發現的一種由CD4+T淋巴細胞分化出的新型輔助性Th亞群，叉狀頭轉錄因子3(forkhead box p3, Foxp3)為標志性轉錄因子[7]。根據Treg的來源及穩定性的不同，可以將其分為兩類，第一類為天然調節性T淋巴細胞(CD4+CD25+Treg)，存在于胸腺中并形成一個相對穩定的趨勢，由于獨特的微環境獲得抑制能力，在免疫穩態中發揮關鍵作用；第二類為誘導調節性T淋巴細胞(induced regulatory T cell, iTreg)，在外來抗原刺激下，經TGFβ誘導非Treg轉化，穩定性較差[8-10]。

CD4+T淋巴細胞分化為Th17與Treg的過程中[11]，IL-6在兩條分化路徑中均起作用，這使得兩種細胞分化存在一定的競爭關系并處于動態平衡中。而且IL-6還可以決定分化途徑的方向，當IL-6不存在時分化向Treg子集；在IL-6存在的情況下則分化向Th17子集。此外由Th17分泌的IL-21與TGFβ一起可激活STAT3途徑增加了RORγt的表達，加大CD4+T淋巴細胞分化為Th17的力度，并抑制Foxp3的表達，從源頭上減少Treg的分化產生[12]。

Th17在機體中表現為免疫監視，可加強免疫反應、促進炎癥發展；是一種高度促炎的細胞，以分泌IL-17為其最主要特征[13]，IL-17包括IL-17A、IL-17F等亞群，可增強針對細胞外細菌、真菌和病毒的適應性細胞免疫應答；還可分泌IL-6、IL-17、IL-21、IL-22、IL-23及TNF等細胞因子，具有募集、活化中性粒細胞等作用。Th17還具有效應器功能，可誘導免疫應答、激活炎性細胞、促進肝細胞炎癥進展、炎癥的慢性轉歸[14]。隨著CHB患者肝臟炎癥的加重及進展，Th17及其分泌的細胞因子也大量增加，因此Th17及其分泌的細胞因子可能是CHB中促進肝臟炎癥進展及損害肝細胞的影響因素之一。在體循環中，IL-17維持炎癥前環境，通過釋放粒細胞巨噬細胞集落因子(granulocyte macrophage colony factor, GM-CSF)刺激粒細胞生成；促進內皮細胞的激活，在外周血中釋放趨化因子5等吸引性趨化因子，大量表達中性粒細胞，導致炎癥的發生，發揮免疫學效應及產生免疫應答[15]。

Treg在機體中主要體現為負向調節，表現為免疫抑制、抗炎、維持免疫系統穩定，防止機體自身抗體對抗原的免疫應答，避免自身免疫性疾病出現及在感染誘導的免疫反應期間過度的誘導T淋巴細胞活化和隨后出現的組織損傷。正常情況下CD4+T淋巴細胞經由TGFβ誘導分化一定數量Treg維持免疫系統穩定；當機體受到致病菌感染時，TGFβ與IL-6一起誘導CD4+T淋巴細胞分化產生大量Th17，導致炎癥發生及進展。Treg在自身免疫性疾病、腫瘤發生與進展、器官移植等方面廣泛參與；雷帕霉素(rapamycin, RAPA)作為一種新的免疫抑制劑，在觀察不同劑量RAPA治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)小鼠模型研究[16]中發現,高劑量RAPA通過誘導實驗小鼠體內Treg擴增來影響Th17/Treg平衡，可更好地緩解EAE小鼠的炎癥。而且大鼠肝移植相關實驗[17]中，通過使用半乳糖凝聚素(galactosin, gal)下調NF-κB/RelB蛋白表達來干擾未成熟樹突狀細胞(immature dendritic cells, imDC)的成熟，促使Treg大量分化并誘導外周免疫耐受，用于治療移植排斥。作用方式分為兩類，第一類為分泌IL-4、IL-10及TGFβ等抑制性細胞因子，通過細胞因子作用于相關受體細胞進行抑制作用，如通過分泌IL-10抑制T淋巴細胞增殖及產生細胞因子；第二類為直接與相應細胞表面受體直接結合進行抑制作用，如細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)與B7配體結合后產生抑制信號，抑制T淋巴細胞的活化[18]從而抑制免疫反應。 Th17/Treg失衡可導致機體免疫系統破壞，進而引起相應的免疫性疾病，如T淋巴細胞中黑素缺乏癥會異常調節Th17與Treg平衡失調，導致自發性結腸炎的發生[19]。

2 Th17/Treg失衡與CHB

Th17可促進CHB患者的免疫活化，其分化頻率增加促進肝臟炎癥進展[20]。Treg分化頻率也呈同等趨勢，但分化程度較Th17弱，故Th17/Treg分化失衡，使得IL-6、TGFα等炎癥誘導因子高水平表達，大量分泌導致中性粒細胞等炎性細胞浸潤，加重肝細胞及肝組織炎癥進展并引起免疫系統反應。Th17分化數量及所占比例升高與CHB患者血清中ALT水平升高呈正相關，但與血清中HBV DNA載量無相關性，故Th17可能促進肝臟炎癥進展并使病程延長，而不是清除CHB患者體內的HBV[21]。Treg分化增加可以有效阻止肝細胞及組織炎癥進展，為減輕肝臟損傷發揮積極作用，避免組織破壞的病理性免疫應答發生；但免疫抑制導致免疫逃逸也為病原體長期存在提供生存空間，延長慢性感染的病程，長此以往使疾病病程延長，并增加疾病加重及惡化風險[22]。

Th17與巨噬細胞關系密切，廣義來說巨噬細胞可分為兩大類，一是經典激活的巨噬細胞(M1型)，被IFNγ、脂多糖(LPS)等介導，具有促進炎癥反應、滅殺微生物和釋放多種炎癥因子等作用，表現為自身抗原呈遞能力上升；二是替代激活的巨噬細胞(M2型)，可分泌TGFβ和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)下調炎癥反應并促進組織修復。HBcAg可以選擇性損害M2表型，并通過Toll樣受體2(TLR2)途徑激活M2巨噬細胞促進炎性細胞因子的產生，進一步加重肝臟炎癥反應[23]。

3 Th17/Treg失衡與肝纖維化、肝硬化

CHB患者未抗病毒治療或治療效果不佳，體內HBV持續大量復制，使肝臟長期處于慢性炎癥；炎癥是慢性肝病的標志性病理特征，持續存在的炎癥可致使肝組織纖維化進而發展為肝硬化。肝纖維化的特征為細胞外基質(ECM)的大量異常形成和累積，從而導致肝臟結構的重塑。肝星狀細胞(HSC)是誘導肝組織纖維化發生、進展的關鍵細胞，HSC本身能夠產生細胞因子和趨化因子，可能是啟動肝纖維化發生的關鍵因素。Sun等[24]通過小鼠四氯化碳肝組織纖維化動物模型發現，Th17/Treg失衡與小鼠肝組織纖維化存在一定相關性，在體外Th17可促進HSC的活化，但被Treg抑制；兩者可以相互轉化，因此糾正兩者平衡，抑制Th17和增加Treg可能為治療肝纖維化的方法之一。

Th17/Treg失衡程度與肝臟炎癥程度和纖維化程度呈正相關[25]。CHB患者體內Th17大量分化，分泌IL-17誘導HSC活化和促進肝纖維化，具體包括HSC的激活，炎癥細胞的募集，促炎和促纖維化細胞因子的表達，刺激膠原合成，導致基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)和組織金屬蛋白酶抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP)之間的失衡[26]。機體正常情況下細胞分泌TIMP拮抗MMP破壞降解酶作用，若拮抗作用減弱或者消失，會導致ECM大量累積。IL-17發揮作用表現為，一方面誘導NF-κB和STAT3快速轉移到細胞核[27]，從而激活IL-6和TNFα等促炎細胞因子和TGFβ等促纖維化因子的基因轉錄；另一方面直接促進HSC增殖、TGFβ受體的上調[9]，使其表達增加。TGFβ是特征明確的促肝纖維化因子，通過兩種途徑共同作用于HSC，使之被激活，產生大量ECM，例如膠原蛋白、蛋白質和糖蛋白的合成，并下調MMP表達和促進TIMP表達來抑制ECM降解，導致ECM異常積蓄[28]，從而促進ECM抑制膠原酶的分解[29]，導致肝纖維化的發生及進展，進而發展至肝硬化。而不可溶彈性蛋白質含量升高，提示肝硬化晚期難以逆轉[30]。CHB相關肝硬化患者中Th17/Treg比值與臨床分期密切相關，可能作為區分代償性肝硬化和非代償性肝硬化的有效指標，不但參與發病而且與病情進展及預后有關[31]。

目前越來越多的研究表明肝硬化的發病機制涉及許多信號通路，如TGFβ/Smad (SMAD) 信號通路，大量激活的TGFβ可以激活SMAD信號通路，促使靜止的HSC轉化為成纖維細胞，進而發展為纖維化最終導致肝硬化[32]。微小核糖核酸(micribonuclease, miRNA)作為基因調控成員并被認為是治療肝臟疾病的一種前景方法，引起了廣泛關注[33-34]。miR-454可以通過抑制Wnt10a的表達來抑制HSC的活化和增殖，從而抑制肝纖維化及肝硬化[35]。

4 Th17/Treg細胞失衡與HCC

盡管相關分子生物學和腫瘤治療手段取得重大進展，HCC術后生存率有所提高，但早期遠處廣泛轉移，早期診斷手段缺乏和不靈敏，局部多次復發，仍讓HCC患者總體生存率仍處于較低水平。當HBV患者進展至肝纖維化甚至肝硬化時，發展至HCC風險極高。

Treg/Th17失衡可致HCC患者免疫力降低，免疫耐受力下降，導致腫瘤細胞的免疫逃逸。Th17通過分泌炎性細胞因子來加強免疫反應，Treg分泌免疫抑制性細胞因子來抑制免疫反應[36]。Treg抑制免疫反應表現為兩方面，一方面通過抑制腫瘤內的細胞引流局部淋巴結內的效應細胞，另一方面是阻止效應T淋巴細胞殺傷腫瘤細胞。相關研究[37]表明，Treg的水平與HCC大小密切相關，腫瘤較大患者外周血中Treg的水平顯著高于腫瘤較小患者，隨著HCC的發展，Treg比例增加，提示對HCC的侵襲和轉移具有促進作用，因此外周血中Treg的數量可能是HCC診斷和預后的潛在標志。以上提示HCC微環境中Treg比例的減少或許會促進腫瘤免疫治療的效果。Th17在HCC發病機制中也存在兩面性，一方面可分泌IL-6激活癌基因STAT3，上調誘導腫瘤血管生成的基因，促進腫瘤的生長和轉移；另一方面可分泌IL-17和IFNγ，增加細胞毒性淋巴細胞(cytotoxic lymphocyte, CTL)的表達，抑制腫瘤的生長[38]。而且在肝癌病灶旁組織中可以發現IL-17細胞因子高表達，與肝臟微小血管密度及增生呈正相關，增加癌組織血管侵犯、臟器轉移等風險[39]；Th17及其分泌的相關細胞因子還隨TNM分期加重而升高，提示可能對HCC的局部免疫產生負面調節作用，總之Th17/Treg失衡加重HCC病情；且相關研究[40]表明，高Th17水平是腫瘤復發的危險因素。在膽道惡性腫瘤中發現，Treg在腫瘤中心積累，表面癌細胞可能已經能夠逃脫宿主免疫系統，而且癌細胞產生的細胞因子，如IL-6和TGF-1在腫瘤微循環中誘導Treg異質性，造成腫瘤的惡化，因此為了延緩腫瘤進展，可能有必要控制Treg[41]。

腫瘤干細胞(cancer stem cells, CSC)是存在于不同類型腫瘤中的細胞亞群，當移植到動物宿主中時具有自我更新、分化和致瘤能力。CSC與腫瘤微環境中的細胞相互作用，并受其調控，進而激活癌細胞中的多種途徑及各種炎癥細胞因子，包括Th17細胞因子網絡。因此調節Th17以抑制CSC存活，是治療腫瘤的一種合理猜想，其作用途徑可通過消除與不良預后相關的Th17細胞因子引起的有害炎癥和刺激Th17細胞因子對腫瘤的抗腫瘤反應兩個方面改善治療預后。在發現Th17前，阻斷IL-23、IL-1β或IL-6的治療方法在臨床上已證明有效，如阻斷IL-1β功能的IL-1受體拮抗劑(IL-1Ra)用于治療類風濕關節炎。IL-21的抗腫瘤作用也在許多腫瘤免疫療法的臨床模型中觀察到，具有刺激細胞毒性并誘導NK細胞產生IFNγ和穿孔素的作用[42]，可使腫瘤消退甚至阻礙腫瘤生長[43]。

5 Th17/Treg細胞失衡與肝衰竭

HBV相關慢性肝衰竭是在肝硬化或HCC基礎上出現的一類重型肝炎，為CHB發展至肝硬化或HCC時并發癥中較為嚴重的一種。臨床上目前主要以對癥支持治療、改善患者癥狀為主。原位肝移植是目前治療慢性肝衰竭較為有效的方法。但肝臟的配型成功率及術后免疫反應是制約成功率的最大障礙。

在肝衰竭過程中，Th17使大量M1型巨噬細胞激活并聚集導致炎癥進一步發展，進而使慢性肝衰竭加重[44]。據Zhang等[45]研究發現，Th17/Treg比值與病情嚴重程度相關，而且高比值也提示CHB相關的慢性肝衰竭患者預后不良；Th17升高程度與疾病嚴重程度為正相關，同時Th17水平較高也是患者死亡的獨立預測因子。相關實驗[46]表明，TGFβ導致小鼠急性肝功能衰竭，除了抑制肝細胞增殖外，還可以誘導細胞死亡，從而導致總體肝細胞損傷增加，加重肝衰竭進程，TGFβ誘導Th17大量分化，分泌大量炎癥因子，導致炎癥風暴。

間充質干細胞表現出可塑性黏連，多譜系分化能力及多功能性基因的表達。可抑制巨噬細胞浸潤，下調巨噬細胞，介導促炎性M1巨噬細胞向消炎M2型巨噬細胞轉化，促進M2巨噬細胞表型和Treg的分化，從而使M1/M2型巨噬細胞比例和Th17/Treg平衡向抗炎狀態傾斜，抑制炎癥進展；同時將CD4+T淋巴細胞系統轉化為抗炎狀態，顯著改善損傷，促進肝細胞增殖和抑制肝細胞凋亡[47]，改善慢性肝衰竭患者肝臟損傷情況，可為改善慢性肝衰竭患者癥狀提供潛在性治療作用[48]。

6 展望

目前CHB治療方案主要為服用核苷酸類似物，可在HBV復制時作為共價閉合環狀DNA(covalently closed circledna, cccDNA)復制的替代模板，使病毒復制失效，但是不能對cccDNA產生作用，無法徹底清除HBV，患者需長期服藥甚至終生服藥。因此單純依靠核苷酸類似物難以徹底治愈CHB，為達到臨床治愈需加用免疫調節制劑，如IFN等，提高患者機體自身免疫力，并且使機體免疫系統重建。

Th17和Treg源于輔助T淋巴細胞，是人體免疫系統重要構成部分。二者失衡在HBV相關肝臟疾病中持續存在，且在每個階段中扮演角色各不相同。詳細了解由CHB進展至HCC、肝衰竭中每個階段Th17和Treg失衡具體情況，依據失衡情況了解病情變化，找到新的治療方案及治療介入最佳時機具有重要意義。故深入研究HBV相關肝臟疾病病程中以輔助T淋巴細胞為首的免疫細胞變化過程及結果，可為疾病的治療提供新方案，并為開發新型藥物及選擇不同藥物治療提供可能性。

作者貢獻聲明：唐光俊負責文獻閱讀，撰寫論文；劉懷鄂、彭玉娟負責提供意見并修改；游晶負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。