紅笛鯛SR-BI基因的原核表達及條件優(yōu)化

王一帆　陳子茵　賈新蕾　黃增朝　呂靜　黃郁蔥

摘 要：根據(jù)GenBank上登錄的紅笛鯛SR-BI基因設計引物，采用RT-PCR方法擴增該基因胞外段序列，然后將該基因胞外段序列定向克隆到原核表達載體pET-28a（+）中，將重組質粒轉入大腸桿菌BL21進行IPTG誘導表達，并對重組表達菌株的表達條件進行優(yōu)化。結果顯示，成功構建了原核表達載體pET28a-SR-BI，并能在大腸桿菌BL21中表達，表達的融合蛋白分子量為50.0ku。融合蛋白的最佳誘導表達溫度、IPTG濃度和時間分別為16℃、0.05mmol/L和8h。研究結果為進一步研究SR-BI的功能奠定了基礎。

關鍵詞：紅笛鯛;SR-BI基因;原核表達;條件優(yōu)化

中圖分類號 S942.1文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2021）03-0001-06

Prokaryotic Expression and Condition Optimization of SR-BI Gene in Lutjanus sanguineus

WANG Yifan et al

（Fisheries College of Guangdong Ocean University/Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals of Guangdong & Key Laboratory of Control for Diseases of Aquatic Economic Animals of Guangdong Higher Education Institute， Zhanjiang 524088， China）

Abstract：A pair of primers were designed based on Scavenger receptor class B type I（SR-BI） gene sequence published in GenBank. The extracellular region sequence of SR-BI gene was amplified by RT-PCR and then inserted into the pET-28a（+） vector to construct prokaryotic expression plasmid. The recombinant plasmid was transformed into E.coli BL21 to overexpressed in the presence of isopropyl-β-D-thiogalato pyranos ide （IPTG）， and the expression conditions of the recombinant strain were optimized. The results showed that the prokaryotic expression plasmid pET28a-SR-BI was successfully constructed and expressed in E. coli BL21. The molecular weight of the expressed recombinant fusion protein was 50.0 ku. The optimal induction expression temperature， IPTG concentration and induction time of the recombinant fusion protein was 16℃， 0.05mmol/L and 8h， respectively. The research results laid the foundation for the further research on the functions of SR-BI.

Key words： Lutjanus sanguineus; SR-BI gene; Prokaryotic Expression; Condition optimization

清道夫受體（Scavenger Recptors，SRs）是一類與膜相關或可溶性的、能結合修飾后的LDL（Low-Density Lipoprotein）或其他多聚陰離子配體的跨膜糖蛋白[1]，首次發(fā)現(xiàn)于小鼠動脈粥樣硬化斑塊的巨噬細胞上存在攝取和降解乙酰化低密度脂蛋白（ac-LDL）的結合位點，后來被稱為巨噬細胞清道夫受體1[2]。根據(jù)分子結構、表達特征及與配體識別機制，目前已發(fā)現(xiàn)的清道夫受體至少包含8種不同類別（A、B、C、D、E、F、G、H）[1]。清道夫受體具有廣泛的受體識別譜，能夠識別修飾低密度脂蛋白、革蘭氏陰性菌細胞壁成分的脂多糖（LPS）和革蘭氏陽性菌細胞壁成分磷壁酸（LTA）多種微生物結構成分，還可識別由細胞膜內轉運到膜外的磷脂酰絲氨酸，并能夠結合多種蛋白質、核苷酸、多糖以及脂類等，參與機體一系列的生理和病理過程，包括動脈粥樣硬化形成或抑制、阿爾茨海默氏病、宿主免疫防御、細胞粘附、凋亡細胞清除、組織保護和維護機體平衡等[3-5]，在動物生命代謝過程中起著重要作用。

清道夫受體BI（Scavenger receptor class B type I，SR-BI）是哺乳動物中研究較為深入的清道夫受體基因家族成員之一，與CD36和LIMPⅡ（lysosomal integral membrane protein Ⅱ）同屬B族清道夫受體[3]。SR-BI為典型的Ⅲ型跨膜糖蛋白，結構如馬蹄樣，由5個區(qū)域構成：1個大的環(huán)狀細胞外域、2個胞內域、2個跨膜域，胞外域中間部分是主要的配體結合區(qū)域。SR-BI是目前在分子水平上證實的第一個高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）受體，介導脂質的選擇性攝取和膽固醇的逆轉運[6]。近年來，越來越多的研究表明，SR-BI不僅參與脂類代謝和與某些代謝性疾病的形成有關外，并且作為模式識別受體在機體先天性免疫中也發(fā)揮著重要作用[7-8]。SR-BI作為一種具有重要功能的模式識別受體，能夠識別許多病原相關分子模式，如LPS[9]、革蘭氏陰性菌（大腸桿菌、沙門氏菌）和革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌、李斯特氏菌）[10]及結核桿菌[11]等，因此作為吞噬性受體直接介導非調理素病原微生物的吞噬或者與TLR（Toll-like receptors）形成共受體調節(jié)促炎癥反應因子共同應答病原微生物，在對外來病原，特別是對細菌及其炎癥反應復合物的免疫應答中發(fā)揮關鍵作用。此外，有研究表明，SR-BI作為（hepatitis C virus，HCV）進入宿主肝細胞的一個可能的靶受體，與丙型肝炎病毒的入侵和感染有關[12-13]。

目前，在水生動物的相關研究較少，目前僅有大西洋鮭（Salmo salar L.）[14]、日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）[15]、日本囊對蝦（Marsupenaeus japonicus）[16]和菲律賓簾蛤[17]等水生動物的SR-BI基因得到克隆鑒定，研究發(fā)現(xiàn)水生動物SR-BI與哺乳動物SR-BI具有相似的結構特征，參與脂質代謝和抗菌免疫，但對于魚類的SR-BI的功能尚未有相關的研究報道。紅笛鯛（Lutjanus sanguineus）是我國南方沿海地區(qū)重要的海水養(yǎng)殖魚種，然而隨著集約化養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大和養(yǎng)殖環(huán)境日益惡化，病害頻繁暴發(fā)，造成了巨大的經濟損失[18]。目前，對于紅笛鯛的免疫系統(tǒng)研究尚處起步階段，已獲得了紅笛鯛的SR-BI基因全長，但尚未見相關的蛋白水平研究。系統(tǒng)研究紅笛鯛SR-BI基因的功能，對于闡明魚類的脂類代謝、免疫識別等重要生理機制具有重要意義。為此，本研究通過構建SR-BI蛋白胞外段基因的原核表達載體，將其轉入到原核表達載體BL21中進行SR-BI重組蛋白的表達，對誘導溫度、IPTG濃度和誘導時間等表達條件進行優(yōu)化，并對SR-BI蛋白進行純化和鑒定，以期為進一步研究紅笛鯛SR-BI的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗用健康紅笛鯛（體質量約500g）購自湛江某海水養(yǎng)殖場;原核表達載體pET-28a（+）、大腸桿菌BL21由本實驗室保存;總RNA提取試劑盒（TriZolTM Up Plus RNA Kit）、cDNA反轉錄試劑盒（TransScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix）購自北京全式金生物技術公司;質粒提取試劑盒（GeneJET Plasmid Miniprep Kit）、瓊脂糖凝膠回收試劑盒（GeneJET Gel Extraction Kit）購自賽默飛世爾科技（Thermo Fisher Scientific）公司;引物、氨芐西林（Amp+）、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）購自上海生工生物工程有限公司;考馬斯亮藍快速染色液、一抗、二抗購自天根生化公司。其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 SR-BI基因的擴增 在無菌條件下取紅笛鯛的脾、頭腎組織，加入液氮研磨組織，于無RNA酶操作環(huán)境下參總RNA抽提試劑盒說明書提取組織總RNA。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，紫外分光光度法檢測其純度和濃度，確保其OD260/OD280在1.8～2.0。組織的總RNA按照cDNA反轉錄試劑盒說明書合成cDNA第一鏈，置-40℃保存待用。根據(jù)筆者提交NCBI的紅笛鯛SR-BI基因胞外段序列（GenBank登錄號：MW246167）設計含EcoRI和XhoI酶切位點上下游引物F/R，上游引物F：CCGGAATTCATGGACGACCAGATCGTTAAAAAC，下游引物R：CCGCTCGAGTTATTCCATAACAGCCGGC。PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以cDNA作為模板擴增SR-BI蛋白的胞外段基因序列，PCR擴增程序為：94℃、3min，94℃、30s，60℃、30s，72℃、60s;35個循環(huán)，循環(huán)結束后72℃延伸6min。PCR反應結束后其產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增的目的片段條帶按切膠回收試劑盒說明書進行切膠回收，回收產物與pMD-18T 載體連接并轉化DH5α感受態(tài)，涂布于氨芐青霉素（AMP）濃度為100μg/mL的LB瓊脂培養(yǎng)基上，挑取單克隆并進行菌落PCR鑒定，陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.2.2 原核表達載體pET28a-SR-BI的構建 將序列測序正確的pMD-18T-SR-BI重組質粒與原核表達空質粒pET28a參質粒提取說明書分別提取質粒，然后用限制性內切酶EcoRI和XhoI分別進行雙酶切，37℃溫水浴中2～3h后，將酶切產物分別進行瓊脂凝膠電泳和切膠回收。將純化后的酶切產物利用T4 DNA連接酶連接到表達質粒pET28a構建成重組質粒pET28a-SR-BI，然后轉入大腸桿菌BL21，涂布于Kana+的LB瓊脂培養(yǎng)基上，進行菌落PCR鑒定，陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，確保構建的表達序列不突變和移碼。

1.2.3 重組蛋白誘導表達 將含有重組質粒pET28a-SR-BI和空質粒pET28a的BL21分別接種于含100μg/mLKana+的LB中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)過夜，將活化的菌種按照1：100的比例接種于含100μg/mLKana+的LB中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)至吸光度（OD600）達0.4～0.6，然后加入0.5mmol/L的誘導劑異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）進行誘導表達6h，取1mL菌液12000g離心1min收集菌液，使用無菌PBS洗滌3次，加入50μL的PBS懸浮菌體，按照1∶5比例加入6×Loading Buffer混勻，100℃煮沸5min，離心后取上清進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析。

1.2.4 原核表達的條件優(yōu)化

1.2.4.1 溫度 IPTG誘導濃度設置為0.1mmol/L，分別于11℃、16℃、22℃和28℃恒溫條件下200r振蕩培養(yǎng)6h，分別離心收集菌體，用PBS清洗菌體后進行超聲破碎。超聲波細胞粉碎機的程序設置為：功率為200w，破碎行6s，間隔8s，破碎至菌液澄清透亮，高速離心分離上清和沉淀，SDS-PAGE分析目的蛋白的表達量。

1.2.4.2 IPTG濃度 IPTG誘導濃度分別設置為0.05、0.1、0.4和0.7mmol/L，16℃、200r/min振蕩培養(yǎng)6h后分別取樣，分別離心收集菌液，蛋白提取和SDS-PAG方法同1.2.4.1。

本研究構建了的原核表達載體pET28a-SR-BI，并在大腸桿菌中成功表達，獲得了融合蛋白最佳誘導表達溫度、IPTG誘導濃度和誘導時間分別為16℃、0.05mmol/L和8h，表達的融合蛋白分子量為50.0ku。

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（責編：張宏民）

基金項目：廣東省自然科學基金項目（2016A030313748）;大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃（CXXL2019139）;南方海洋科學與工程廣東實驗室（湛江）自主項目（ZJW-2019-06）。

作者簡介：王一帆（1996—），男，河北人，碩士生，研究方向：水產動物病害防治。 *通訊作者? 收稿日期：2020-12-24