3種木材DNA提取方法比較研究

余敏　魏宇創(chuàng)　張浩　劉盛全

摘 要：以微凹黃檀木材標(biāo)本為研究對象，分別采用BATB法、PTB法和SDS法對微凹黃檀不同部位木材進(jìn)行DNA提取試驗(yàn)，并擴(kuò)增DNA條形碼序列ITS2、trnH-psbA和matK，分析不同DNA提取方法對微凹黃檀木材DNA提取和DNA條形碼序列擴(kuò)增的影響。結(jié)果表明：采用BATB法從微凹黃檀木材心、邊材組織中提取的DNA濃度以及DNA條形碼擴(kuò)增效率均要高于其他2種方法，說明BATB法更適合從長期存儲木材中提取DNA。

關(guān)鍵詞：微凹黃檀;DNA提取;DNA條形碼;木材識別

中圖分類號 S781.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2021）03-0006-04

Comparison of Three Methods of DNA Extraction from Wood

YU Min et al.

（School of Forestry & Landscape Architecture， Anhui Agricultural University， Hefei 230036，China; Key Lab of State Forest and Grassland Administration on “Wood Quality Improvement & High Efficient”， Hefei 230036， China）

Abstract：The xylarium wood specimens of Dalbergia retusa were selected from the Wood Collection. Three methods， i.e.， BTAB， PTB and SDS were employed to extract DNA in sapwood and heartwood for further PCR amplification of three potential DNA barcode sequences （ITS2， trnH-psbA， and matK）. The effects of different methods on DNA extraction and PCR for target sequences were analyzed. The results showed that the concentration of DNA and efficacy of PCR using BTAB method was higher than that of PTB and SDS methods from sapwood and heartwood. The BTAB method is more suitable for extracting DNA from long-stored wood.

Key words：Dalbergia retusa Hemsl.; DNA extraction; DNA barcodes; Wood identification

相較于新鮮、幼嫩且具有分生能力的植物組織而言，從木材組織中提取和擴(kuò)增DNA要困難得多，尤其是木材經(jīng)過干燥和長期存儲，進(jìn)一步影響了DNA提取和擴(kuò)增成功率[1]。隨著DNA條形碼技術(shù)在木材識別研究上的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)從木材組織中提取足夠質(zhì)量和數(shù)量的DNA，是順利應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)識別和鑒定木材的基礎(chǔ)和保證[2]。雖然已有研究報(bào)道了采用常規(guī)DNA提取方法提取木材組織DNA，但提取結(jié)果常常不能滿足后續(xù)試驗(yàn)的需要[3]。因此，在傳統(tǒng)的DNA提取方法基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化木材DNA提取步驟，提高木材DNA提取效率和有效性，是長期存儲木材DNA提取亟待解決的問題。為此，筆者以標(biāo)本館館藏微凹黃檀木材標(biāo)本為研究對象，分別采用BATB法、PTB法和SDS法對微凹黃檀木材進(jìn)行DNA提取試驗(yàn)，并擴(kuò)增DNA條形碼序列ITS2、trnH-psbA和matK，分析不同DNA提取方法對微凹黃檀木材DNA提取和DNA條形碼序列擴(kuò)增的影響，探索適合長期存儲木材基因組DNA提取的方法，以期為進(jìn)一步開展長期存儲木材DNA條形碼識別研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 微凹黃檀木材標(biāo)本來自安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)木材標(biāo)本館。由于木材組織疏松多孔，運(yùn)輸和儲存過程中易被其他外源植物組織污染，因此在進(jìn)行木材DNA提取試驗(yàn)操作之前，需用無菌刀片去除木材表面部分，并將試樣切成小片放置在全自動冷凍研磨儀（Retsch CryoMill）中研磨成木粉，避免木材組織在研磨過程中因溫度過高造成DNA二次降解。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 木材DNA提取 分別采用BATB法、SDS法和PTB法對微凹黃檀標(biāo)本心、邊材進(jìn)行提取。BATB法：向500mg木粉中加入4.5mL BoTab buffer、225μL DTT（1mol/L）、90μL蛋白酶K（20mg/mL），渦旋混勻;55℃水浴5h，期間顛倒混勻;加入4.5mL氯仿∶異戊醇（24∶1），渦旋混勻;用旋轉(zhuǎn)混勻儀室溫下混勻10min;12000rpm，4℃離心15min;用5mL槍頭小心吸取上層水相到新50mL離心管中，加入等體積氯仿∶異戊醇（24∶1），上下顛倒混勻;12000r，4℃離心5min;移取上層水相，加入2.5倍體積的醋酸鈉（3mol/mL，pH 5.2）;加入與上層水相等體積的預(yù)冷異丙醇和糖原，混合均勻;-20℃低溫放置2h;12000r，4℃離心15min，丟棄上清;加入5mL 70%無水乙醇洗滌白色沉淀物，輕彈離心管底數(shù)次。12000r，4℃離心15min;小心去除上清液，不要使白色沉淀流失。加入200μL無菌水，輕離心后置于4℃低溫冰箱溶解1h，放入-20℃保存?zhèn)溆谩DS法[4]和PTB法[5]參照已發(fā)表文獻(xiàn)方法進(jìn)行DNA提取操作。

1.2.2 基因組DNA的純化 前期研究表明[6]，木材DNA提取原液中常含有未能徹底去除的色素等雜質(zhì)，這些物質(zhì)不僅干擾核酸的紫外吸收值，并且對后續(xù)PCR擴(kuò)增反應(yīng)具有強(qiáng)烈的抑制作用。因此，需要對提取后的DNA原液進(jìn)行純化處理，以滿足下一步PCR擴(kuò)增的需要。木材DNA純化采用PCR擴(kuò)增模板純化試劑盒（High Pure PCR Template Preparation Kit，Roche）進(jìn)行操作。

1.2.3 DNA純度和濃度檢測 用DeNovix DS-11FX核酸定量儀檢測純化后樣品的A260和A280紫外吸收值。

1.2.4 DNA條形碼片段的PCR擴(kuò)增 為分析不同DNA提取方法對PCR擴(kuò)增反應(yīng)的影響，分別以3種方法提取的微凹黃檀木材不同部位純化后的基因組DNA為模板，擴(kuò)增3條DNA條形碼候選片段：核基因組內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔片段ITS2、葉綠體基因間隔區(qū)域trnH-psbA以及葉綠體基因片段matK。3條DNA條形碼序列擴(kuò)增引物信息和反應(yīng)體系詳見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同DNA提取方法提取微凹黃檀木材DNA的濃度和純度 分別采用3種DNA提取方法提取微凹黃檀心、邊材DNA。提取后的木材DNA原液經(jīng)純化后檢測樣品在260nm和280nm下的紫外吸收值，計(jì)算A260/A280的比值，測算純化后的基因組DNA濃度。由圖1可知，BATB法從心、邊材組織中提取的DNA濃度均高于其他2種方法，PTB法提取的木材DNA濃度最低;3種DNA提取方法提取的邊材DNA濃度均高于心材部分。由圖2可知，BATB法提取的微凹黃檀心、邊材DNA的A260/A280值均接近2.0，純化后純度較好;PTB法提取的微凹黃檀心、邊材DNA的A260/A280值均小于1.5，純化后的DNA仍存在蛋白質(zhì)污染。

BATB法在經(jīng)典的CTAB法基礎(chǔ)上增加了糖原作為共沉劑。糖原作為惰性載體，離心時可使核酸分子聚于其上達(dá)到共沉淀的效果。試驗(yàn)結(jié)果表明，糖原能夠有效地幫助降解木材的DNA小片段富集沉淀，提高DNA提取濃度，并進(jìn)一步增加核酸沉淀效率。后續(xù)的純化操作采用試劑盒進(jìn)行操作，不僅減少了氯仿等有機(jī)試劑的使用，而且純化小柱能夠有效減少和避免DNA純化過程中的污染。

2.2 不同DNA提取方法對微凹黃檀DNA條形碼序列擴(kuò)增的影響 以純化后的微凹黃檀心、邊材DNA為模板，分別擴(kuò)增核基因組內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔片段ITS2、葉綠體基因間隔區(qū)域trnH-psbA以及葉綠體基因片段matK，分析不同DNA提取方法對微凹黃檀木材DNA條形碼序列擴(kuò)增的影響。由圖3可知，采用BATB法和SDS法提取的DNA模板均可以擴(kuò)增出微凹黃檀ITS2片段，而以PTB法提取的DNA為模板擴(kuò)增ITS2序列失敗。ITS2片段在細(xì)胞核基因組中具有豐富的拷貝數(shù)量，能夠?yàn)橐呀到獾腄NA模板提供足夠數(shù)量的擴(kuò)增模板。本研究中采用PTB法提取的微凹黃檀心、邊材DNA的A260/A280值均小于1.5，表明其存在蛋白質(zhì)等污染，而這些物質(zhì)會干擾PCR擴(kuò)增反應(yīng)的順利進(jìn)行。

由圖4可知，采用BATB法和SDS法提取的微凹黃檀心、邊材DNA為模板可以成功擴(kuò)增出trnH-psbA片段;而采用PTB法提取的微凹黃檀邊材DNA為模板可以擴(kuò)增出trnH-psbA片段，從心材中提取的DNA為模板無法擴(kuò)增成功，較低的濃度無法滿足擴(kuò)增trnH-psbA序列的要求，從而導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。

由圖5可知，3種DNA提取方法提取微凹黃檀心、邊材DNA擴(kuò)增matK序列，僅有BATB法提取的邊材和心材部分可以成功擴(kuò)增出matk片段。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明：BATB法從微凹黃檀心、邊材組織中提取的DNA濃度和純度均高于其他2種方法，PTB法提取的木材DNA濃度最低;以BATB法提取的微凹黃檀心、邊材DNA為模板，擴(kuò)增效果要優(yōu)于其他2種方法。通過比較3種DNA提取方法對木材標(biāo)本心、邊材DNA的提取效果和擴(kuò)增效率可知，BATB法和SDS法均要優(yōu)于PTB法，且BATB法更適合長期存儲的木材DNA提取。

相較于新鮮、幼嫩的植物葉片而言，從木材組織獲取DNA并擴(kuò)增出相應(yīng)的基因片段存在著諸多不利因素，主要表現(xiàn)在：（1）木質(zhì)部細(xì)胞編程性死亡過程中，DNA失去原生質(zhì)體的保護(hù)，多降解成小片段且數(shù)量和質(zhì)量均發(fā)生變化[7]。（2）木材中含有大量的厚壁管狀分子，在提取木材組織中的DNA時需要處理纖維、導(dǎo)管類的堅(jiān)硬組織，這會導(dǎo)致產(chǎn)生高溫?zé)崃浚@些熱量將導(dǎo)致不可逆的DNA分子降解[8]。（3）木材組織中的次生代謝物質(zhì)和多酚類化合物易于氧化，氧化的多酚極易結(jié)合核酸分子導(dǎo)致DNA進(jìn)一步降解。此外，木材中存在的蛋白質(zhì)、酚類、多糖、單寧和色素等物質(zhì)會影響DNA聚合酶的活性，干擾引物與模板的結(jié)合，從而導(dǎo)致PCR擴(kuò)增的失敗[9]。（4）木材存儲環(huán)境和時間的影響，如潮濕環(huán)境下極易造成木材腐朽和真菌污染，導(dǎo)致DNA的進(jìn)一步降解和污染。木材組織中的DNA也會隨著儲存時間的延長逐漸發(fā)生降解[10]。（5）木材加工過程中通常會有紫外線照射、化學(xué)處理和熱處理等，這些處理將導(dǎo)致木材組織中殘存的DNA進(jìn)一步降解[11]。

參考文獻(xiàn)

[1]Xiaoshu Tang， Guangjie Zhao， Liyan Ping. Wood identification with PCR targeting noncoding chloroplast DNA [J]. Plant Molecular Biology， 2011， 77（6）：609-617.

[2]Lee Hong Tnah， Soon Leong Lee， Kevin Kit Siong Ng， et al. DNA extraction from dry wood of Neobalanocarpus heimii （Dipterocarpaceae） for forensic DNA profiling and timber tracking [J]. Wood Science and Technology， 2012， 46（5）：813-825.

[3]Lichao Jiao， Yafang Yin， Fuming Xiao， et al. Comparative analysis of two DNA extraction protocols from fresh and dried wood of Cunninghamia lanceolata （Taxodiaceae） [J]. IAWA Journal， 2012， 33（4）：441-456.

[4]王娟.不同溫度干燥處理下的降香黃檀木材DNA提取方法的研究[D].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[5]余敏，張浩，劉盛全，等.降香黃檀木材DNA提取及rDNA-ITS序列條形碼分子鑒定[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)， 2014， 34（5）：103-108.

[6]Min Yu， Kai Liu， Liang Zhou， et al.Testing three proposed DNA barcodes for the wood identification of Dalbergia odorifera T. Chen and Dalbergia tonkinensis Prain[J]. Holzforschung， 2016，70（2）：127-136.

[7]M.F. Deguilloux， M.H. Pemonge， R. Petit.Novel perspectives in wood certification and forensics：dry wood as a source of DNA [J]. Proceedings of the Royal Society of London. Series B：Biological Sciences， 2002， 269（1495）：1039-1046.

[8]K. Weggler， M. Dobbertin， E. Juengling， et al.Dead wood volume to dead wood carbon：the issue of conversion factors [J]. European Journal of Forest Research， 2012， 131（5）：1423-1438.

[9]Lichao Jiao， Tuo He， Eleanor E. Dormontt， et al. Applicability of chloroplast DNA barcodes for wood identification between Santalum album and its adulterants[J].Holzforschung， 2019， 73（2）：209-218.

[10]Yanti Rachmayanti， Ludger Leinemann， Oliver Gailing， et al.DNA from processed and unprocessed wood：factors influencing the isolation success[J].Forensic Science International：Genetics， 2009， 3（3）：185-192.

[11]Mervyn Shepherd， Michael Cross， Rhonda L Stokoe， et al. High-throughput DNA extraction from forest trees[J]. Plant Molecular Biology Reporter， 2002， 20（4）：425.

（責(zé)編：徐世紅）

基金項(xiàng)目：安徽省國際科技合作計(jì)劃項(xiàng)目（1704e1002226）;安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（1908085QC111）。

作者簡介：余敏（1985—），男，河南信陽人，講師，研究方向：木材DNA識別。 *通訊作者? 收稿日期：2021-01-08