草魚體表粘液凝集素制備及其性質研究

劉帥　董毓卿　岳福鵬　張樹民　李偉

摘 要：以草魚體表粘液凝集素為研究對象，經PBS提取粗提物后，通過離子交換層析DEAE-52對該凝集素進行初步純化，得到一種具有凝集雞血細胞的凝集素。該凝集素在20～40℃及pH 7～8條件下表現出較好的凝集活性，且凝集活性不依賴Ca2+的存在。依據凝血活性糖抑制試驗結果，推測草魚體表粘液凝集素可能為半乳糖結合凝集素。

關鍵詞：草魚;體表粘液;凝集素

中圖分類號 Q26;Q959.4文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2021）03-0009-03

Study on Preparation and Characterization of Lectin from Surface Mucus of Ctenopharyngodon idellus

LIU Shuai1 et al.

（1School of Agriculture， Hetao College， Bayannur 015000， China）

Abstract： The lectin from surface mucus of Ctenopharyngodon idellus was extracted by PBS and purified by ion exchange chromatography with DEAE-52 to obtain a lectin with agglutinated chicken blood cells.The lectin exhibited good agglutination activity at 20～40℃ and pH 7～8， and the agglutination activity of the lectin was independent of the presence of Ca2+. Based on the results of coagulation active sugar inhibition test， it was speculated that the mucus lectin of Ctenopharyngodon idellus might be galactose-binding lectin.

Key words： Ctenopharyngodon idellus; Surface mucus; Lectin

魚類體表粘液是由其皮膚腺細胞分泌的，含有多糖、蛋白質和纖維類等多種物質。多項研究表明，魚類體表粘液具有免疫學功能，在魚類先天性免疫中發揮著非常重要的作用[1，2]。魚類的先天免疫因子包括溶菌酶、抗菌肽、模式識別受體、補體、細胞因子、凝集素及轉鐵蛋白等[3-5]。其中，凝集素因其特異性的識別功能，近年來已逐漸成為學者的重點研究對象。

草魚（Ctenopharyngodon idella）是我國四大淡水魚之一，營養豐富，價格低廉，深受消費者青睞。近年來，隨著養殖規模的擴大以及水體環境污染和集約化養殖模式的發展，草魚的生存環境面臨多重威脅。筆者在研究魚類免疫機制過程中，發現對草魚凝集素的研究大多集中在草魚血清凝集素，而對于草魚體表粘液凝集素的研究尚未見報道。為此，筆者從草魚體表粘液中發現一種天然凝集素，并對其部分理化性質及生物學性質進行了研究，以進一步明確草魚免疫機制。

1 材料與方法

1.1 供試材料 2～3齡草魚，購于巴彥淖爾市車站市場;雞血細胞購自河南一祺生物技術有限公司。供試試劑包括：Cellulose DE 52（英國Whatman公司產品）;D-葡萄糖、水蘇糖、D-海藻糖、D-山梨糖醇、D-蜜三糖、D-果糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、D-木糖、D-甘露糖（均為RuiBio公司產品）;豬胃黏蛋白（合肥博美生物科技有限公司）;其他試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 草魚體表粘液采集 取混有體表粘液草魚鱗片，按1∶3（w∶v）分別加入TBS（pH 7.2，0.01mol/L）、PBS（pH 7.2，0.01mol/L）、生理鹽水（0.09% NaCl）及蒸餾水中，浸泡過夜。4000r/min離心15min取上清液，測定凝血活力后，凍干得到草魚粘液粗提物，4℃保存備用。

1.2.2 草魚體表粘液凝集素凝血活力測定 取樣品溶液25μL于96孔U型凝血板中，依次進行連續倍比稀釋，稀釋液為PBS（pH 7.2，0.01mol/L）緩沖液，然后每孔再分別加入用TBS（pH7.2，0.01mol/L）緩沖液稀釋至2%雞血細胞，靜置2h觀察凝集現象。凝血活力以產生凝集現象最大稀釋倍數的倒數表示（以2n表示）[6]。

1.2.3 草魚體表粘液凝集素的制備 使用DEAE-52對草魚體表粘液凝集素進行分離。將草魚粘液粗提物溶于0.01mol/L Tris-HCl，得到濃度為5mg/mL樣液，層析柱（預裝柱規格為φ16mm×300mm）上樣量為2mL，以1mL/min的速度通過自動部分收集器對洗脫液進行收集。采用梯度洗脫，前30管NaCl濃度為0mol/L，從第31～120管NaCl濃度為0～1mol/L，每管收集3mL，分別在280nm處測定各管吸光度值，繪制洗脫曲線，并收集具有凝血活性的組分。

1.2.4 糖抑制試驗 分別配置濃度為0.05mg/mL的D-葡萄糖、水蘇糖、D-海藻糖、D-山梨糖醇、D-蜜三糖、D-果糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、D-木糖、D-甘露糖、豬胃黏蛋白溶液。參照1.2.2方法，再加入2%血細胞前，每孔加入25μL上述糖溶液，靜置2h，觀察并記錄結果。

1.2.5 pH對凝集活性的影響 將分離出草魚體表粘液凝集素凍干粉分別溶于pH 3～11的緩沖液中，測定凝血活性。其中：pH 3～5為磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液，pH 6～7為磷酸鹽緩沖液，pH 8為Tris-HCl緩沖液，pH 9～10為甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，pH 11為氫氧化鈉溶液。

1.2.6 溫度及時間對凝集活性的影響 將分離出的草魚體表粘液凝集素置于30、40、50、60、70℃各1h，并分別在1h內的第5、10、20、30、40、50、60min取樣，測定其凝血活性。

2 結果與分析

2.1 不同提取液對草魚體表粘液凝集素提取的影響 由表1可知，生理鹽水（0.09% NaCl）和蒸餾水作為草魚體表粘液凝集素提取溶劑時，能夠溶出一定量的凝集素，但溶出量并不顯著;而PBS（pH 7.2，0.01mol/L）和TBS（pH 7.2，0.01mol/L）均能有效提高凝集素的溶出量，且PBS與其他3種提取溶劑相比，顯著提高了凝集素的溶出量，這與PBS常作為溶解蛋白質類物質的緩沖溶劑性質相符。凝血活力測定實驗中，分別采用PBS和TBS 2種緩沖液作為稀釋液，TBS緩沖液作為稀釋液時凝血活力為28，而PBS緩沖液作為稀釋液時凝血活力為26，說明TBS作為稀釋液能顯著提高凝集素的凝血活性。此外，使用胰蛋白酶處理過的血細胞與正常使用TBS處理的血細胞的凝血活力無明顯差異，并且該凝集素的凝集活性不依賴Ca2+存在，因此后續試驗中使用的倍比稀釋液均為TBS緩沖液。

2.2 草魚體表粘液凝集素的分離 將凍干后的草魚體表粘液粗提物用PBS溶解后，過DEAE-52離子交換層析柱，測定自動部分收集器收集各試管在280nm處的吸光度值所繪制洗脫曲線如圖1所示。由圖1可知，共得到3個吸收峰，經測定發現第2個峰具有較好的凝血活性，其他部分凝血活性較低或無凝血活性。合并、透析、凍干具有凝血活性的蛋白峰，后期可通過體積排阻色譜及高效液相色譜進行進一步純化。

2.3 糖和糖蛋白對草魚體表粘液凝集素活性的影響 能夠以非共價鍵與糖或糖蛋白特異性結合，無論是單糖、寡糖還是多糖都可能對凝集素的凝集活性產生抑制作用，因此研究凝集素的糖抑制性非常必要[7]。由表2可知，草魚體表粘液凝集素的凝血活性受到D-蜜三糖、D-半乳糖和豬胃黏蛋白的抑制，其最小抑制濃度分別為3.13、0.39、0.39μg/mL。蜜三糖是由半乳糖、果糖和葡萄糖結合而成，說明草魚體表粘液凝集素可能為半乳糖結合凝集素;而豬胃黏蛋白對草魚體表粘液凝集素的凝血活性也有很強的抑制作用，說明豬胃黏蛋白上的糖鏈結構與草魚體表粘液凝集素結合位點的結構域高度互補。

2.4 pH對草魚體表粘液凝集素活性的影響 不同pH對草魚體表粘液凝集素凝血活力影響的試驗結果如表3所示。由表3可知，pH在3～4時，草魚體表粘液凝集素無凝血活力;pH在5～7時，凝血活力隨pH升高而急劇增高，表明酸性條件能夠影響凝集素糖結合域（CRD）的位置，從而降低凝集素的凝血活性[8];pH在7～8時，凝集素的凝血活力達到最大（28）;pH在9～11時，凝集素凝血活性隨pH的增加而緩慢降低，表明OH-可能會改變凝集素電離狀態，從而降低了凝集素的凝血活性[9]。

2.5 溫度及時間對凝集活性的影響 不同溫度及時間對草魚體表粘液凝集素活性的影響試驗結果如表4所示。由表4可知，草魚體表粘液凝集素在常溫下（24℃）和30℃時，凝血活力最高（28），且隨時間增加，凝血活力變化明顯。當溫度升高后，凝集素的凝血活力隨溫度及時間的增加而明顯降低。在40℃熱處理條件下，30min后，凝集素的凝血活力下降了25%;在50℃熱處理條件下，20min內凝集素的凝血活力顯著下降，到30min時凝集素開始失活;在60℃熱處理條件下，5min后凝集素開始失活;而70℃時凝集素完全失活。由此可見，凝集素的凝血活性與處理溫度和時間不具有線性關系，而是會在溫度或時間超過某一值時突然下降。

3 結論與討論

魚類凝集素是魚類先天免疫的重要組成部分，在魚體免疫方面發揮著重要作用。魚類的先天免疫因子包括溶菌酶、抗菌肽、模式識別受體、補體、細胞因子、凝集素及轉鐵蛋白等。其中，凝集素因其特異性的識別功能，近年來逐漸成為學者們的重點研究對象。

本研究以草魚體表粘液凝集素為研究對象，經PBS提取粗提物后，通過離子交換層析DEAE-52對該凝集素進行初步純化，得到一種具有凝集雞血細胞的凝集素。該凝集素在20～40℃及pH 7～8條件下表現出較好的凝集活性，且該凝集素的凝集活性不依賴Ca2+的存在。依據凝血活性糖抑制試驗結果，推測草魚體表粘液凝集素可能為半乳糖結合凝集素。

魚類凝集素成員種類繁多，幾乎具有復雜的凝集素家族所有組成成分，各類凝集素還具有多種亞型，在魚體免疫方面發揮著重要作用。近年來，隨著生物技術的發展，不斷有新的魚類凝集素被發現，但其作用的分子機制尚不十分清楚。因此，魚類凝集素的深入研究，對提高魚類免疫及魚病防控等方面具有重要的指導意義。

參考文獻

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（責編：徐世紅）

基金項目：2017年河套學院自然科學研究一般項目（HYZQ201716）。

作者簡介：劉帥（1982—），男，內蒙古巴彥淖爾人，講師，從事食品生物活性物質研究工作。? 收稿日期：2021-01-03