基于SSR分子標記的遺傳學實驗教學項目設計與探討

李 楠，郭海濱，李亞娟，劉自強

（1.華南農業大學 公共基礎課實驗教學中心，廣東 廣州 510642；2.華南農業大學 農學院，廣東 廣州 510642）

遺傳學是生命科學領域一門重要的基礎、前沿學科，是生物學專業綜合性較強的核心課程[1]。遺傳學理論多是從實驗中總結而來，實驗在遺傳學教學中具有十分重要的地位。當前，受高校教育專業化影響，遺傳學綜合性實驗內容往往只對應理論中的某個知識點，當學生經過綜合性實驗學習，進入研究性實驗時，很少能提出切實可行的實驗方案，說明學生對知識的整合應用能力有待提升。2019年的“新農科”建設提出，以“融合發展”推動農林高校的內部改革及“兩金一高”農林教育質量新標準，希望通過科教融合、產學研結合的人才培養模式，打破固有的學科邊界、專業壁壘，推進“兩性一度”金課建設[2]。在該思想指導下，我校遺傳學教研團隊深入開展科教融合人才培養模式探索，以科研成果為突破口，借助科研材料的表型優勢，以及科研實驗的前瞻性、綜合性及連續性優勢，進行了多學科、跨專業實驗項目建設。本文所介紹的實驗即為其中的一項跨專業綜合性實驗。該實驗利用了明顯的水稻葉色表型差異，融合了遺傳學實驗中的水稻雜交技術、遺傳分析和基因連鎖分析，以及植物生理學實驗中的水稻育苗技術與葉綠體色素提取方法，并通過線上虛擬仿真實驗與線下課堂實驗、課內實驗及課外開放實驗緊密結合，打破了實驗的時空束縛，對培養學生跨專業知識整合運用能力及創新研究能力具有重要作用。

1 實驗材料的背景與設計思路

經甲基磺酸乙酯（ethal methane sulfonate，EMS）誘變縉恢 10號（J10）后，獲得一個黃綠葉突變體ygl4(t)。因葉色與光合作用關系密切，葉色變異成為科學研究中的熱點。研究表明，全生育期的黃化型葉色突變體多由隱性核基因控制[3-4]，變異會影響葉綠素的生物合成與降解，導致光合效率下降[5]。在對ygl4(t)的研究中發現，其突變性狀受一對隱性核基因控制，該基因位于水稻第10染色體 RM1162與 RM7093之間[6]。

為使其更好地應用于實驗教學，課題組進行了如下教學設計。以ygl4(t)和J10的葉片以及ygl4(t)和西農1A構建的F1及F2種子作為課程實驗材料。首先，向學生介紹化學誘變劑（EMS）及其在科學研究中的重要應用價值，引出J10和ygl4(t)這對野生型與突變體材料，使學生通過觀察兩種材料的葉片葉色表型，直觀了解野生型與突變體的概念及其差異。然后進行葉綠素含量測定實驗，通過數據對比提出科學問題。其次，引導學生探討如何針對該類型突變體，構建合適的遺傳分析與基因連鎖分析群體，并結合水稻田間雜交虛擬仿真實驗，學習基因連鎖分析的群體構建方法及水稻雜交技術。再次，向學生提供已構建好的遺傳分析材料（包括親本（ygl4(t)和西農 1A）及 F1和F2種子），結合課外開放實驗，學習水稻育苗技術和遺傳分析方法，探索表型差異下的基因型差異，進而理解基因型與表型的內在聯系。最后，引導學生用所收集的F2群體中黃綠葉突變體葉片為實驗材料，利用SSR分子標記，學習基因連鎖分析方法，定位該突變基因，繪制遺傳圖。該實驗整個教學設計基于問題引導式教學模式（problem based learning，PBL），以培養學生科學研究和整合應用能力為目的。

2 實驗項目設計

2.1 實驗目的

（1）了解 EMS誘變及其應用價值，學習質量性狀基因的遺傳分析方法、基因連鎖分析群體構建方法及水稻雜交技術；

（2）學會配制植物營養液，掌握水稻育苗技術，了解水稻生長過程；

（3）掌握葉綠素含量測定方法和基因連鎖分析方法，了解基因型與表型的關系；

（4）學會分析電泳結果，掌握統計處理方法。

2.2 涉及的主要理論知識與實驗技術

該實驗涉及的理論知識點與實驗技術主要包括：經化學誘變所引起的基因突變、水稻生長發育過程及其育苗技術、植物葉綠體色素作用及其提取技術、水稻雜交技術、分離定律、微衛星標記、基因連鎖分析及遺傳作圖等。

EMS誘變屬于烷化劑誘變中的一種，能將 DNA分子中的堿基烷基化，進而因堿基替代形成點突變。當前EMS是化學誘變中效果最好的一種誘變劑[7]。

植物葉綠體色素包括葉綠素a、葉綠素b、β-胡蘿卜素和葉黃素，是進行光合作用的重要物質。因其不溶于水，而溶于有機溶劑，因此可用乙醇或丙酮等進行提取，并采用分光光度計精確測定[8]。

SSR標記是一種以特異引物 PCR（聚合酶鏈式反應）為基礎的分子標記技術。在真核基因組中存在串聯重復序列，由10—50個重復單元（1—6個核苷酸）串聯組成。由于其重復單元小，長度短，GC含量偏離基因組平均值，因此又將其稱為微衛星序列[9]。

基因連鎖分析是指利用分子標記與目標性狀的連鎖關系，在一個目標性狀的分離群體中把目的基因定位于染色體的一定區域內。主要技術包括基因組DNA提取、PCR和聚丙烯酰氨凝膠電泳[10]。

2.3 實驗材料

實驗材料ygl4(t)、J10和西農1A均由西南大學水稻研究所提供。以ygl4(t)和J10葉片及ygl4(t)和西農1A構建的F1和F2種子作為課程實驗材料。

2.4 實驗方法

2.4.1 葉綠素含量測定

參照Lichtenthaler等方法[11]，在水稻處于抽穗期時，將材料移入實驗室中，讓每組學生采集ygl4(t)與J10各 3株的劍葉、倒二葉和倒三葉，用研磨法提取水稻葉片葉綠素。即在研缽中加入少量石英砂和95%乙醇研磨至組織變白，然后將提取液轉入25 mL容量瓶中定容，用分光光度計分別測定其在 470 nm、645 nm和663 nm處的吸光值。

2.4.2 基因連鎖分析群體構建與水稻育苗培養

在課堂上，先和學生探討如何構建適合ygl4(t)突變體遺傳分析與基因連鎖分析的群體；再提供給學生ygl4(t)、J10、西農 1A、F1種子和 F2種子，結合田間拍攝群體構建時的視頻與圖片資源，介紹本實驗提供的群體構建策略，繪制構建過程圖；然后學生用電腦訪問“華南農業大學虛擬仿真實驗教學項目管理平臺”（http://222.201.224.39/virexp/）[12]，進入水稻幼穗分化實驗項目中的水稻雜交虛擬仿真實驗進行學習。

參考梁瑞等的方法[13]，挑選健康飽滿的水稻種子，用5%次氯酸鈉浸泡約15 min，再用蒸餾水清洗3次后，置于培養箱中 37 ℃恒溫暗培養。出芽后，加入營養液，將白天溫度調至35 ℃光照培養16 h，夜間28 ℃暗培養8 h，養至三葉期備用。

2.4.3 遺傳分析與基因連鎖分析

收集ygl4(t)、西農1A及F1各10株的葉片和200株 F2群體葉片，以葉片黃綠色和綠色為區分，進行F2群體葉色表型統計。統計完成后，將F2群體中黃綠葉突變體葉片獨立包裝于密封袋中，標記后置于超低溫冰箱中備用。然后提供給學生2條不同染色體上的4對 SSR引物（見表 1），對兩親本與 F2突變群體進行基因連鎖分析。基因連鎖分析可參考劉自強等[14]的方法，包括水稻DNA提取、聚合酶鏈式反應PCR、聚丙烯酰氨凝膠電泳。在電泳帶型統計中，將AA記為ygl4(t)純合帶型，BB記為西農 1A純合帶型，AB記為雜合帶型。

表1 引物序列

2.5 實驗結果與討論

2.5.1 葉綠素含量測定結果

圖1 野生型WT和突變體ygl4(t)的葉色表型

表2 突變體與野生型的葉綠素含量比較

從圖1可以看出，野生型WT（J10）葉片為綠色，而突變體ygl4(t)葉片呈黃綠色。表2的葉綠素含量測定結果表明，ygl4(t)除葉綠素 a的含量與 J10相比無差異外，總葉綠素、葉綠素 b、葉綠素 a與葉綠素 b的比值（Chla/Chlb）均與J10有顯著差異，其中葉綠素b及Chla/Chlb的差異達到極顯著水平。ygl4(t)中Chla/Chlb的值達到25.94，約為WT的7.35倍。

2.5.2 基因連鎖分析群體構建與水稻雜交

為了便于進行基因連鎖分析，在與學生討論后，通過引入遺傳背景差異較大的西農 1A進行遺傳分析群體構建，可以獲得更多具有多態性的SSR分子標記用來進行 F2群體的連鎖分析。F2群體構建的過程如圖2所示。

圖2YGL4(t)基因連鎖分析群體構建過程

結合我校虛擬仿真實驗教學項目管理平臺，學生可進入水稻幼穗分化實驗項目水稻雜交虛擬仿真實驗中，通過虛擬操作已掌握的實驗材料雜交時期判斷、水稻去雄、套袋及授粉方法，結合田間水稻雜交實操視頻資源，更加直觀地學習水稻雜交過程（見圖3）。

圖3 水稻雜交虛擬仿真實驗

2.5.3 遺傳分析與基因連鎖分析

對 F1及 F2群體葉色的調查發現，F1葉色正常，為綠色，而F2分離群體出現葉色分離，其中正常株有153株，黃綠葉有47株。卡方測驗表明，正常株與突變株分離比例符合表明該ygl4(t)的突變性狀受一對隱性核基因控制。

利用分布在水稻2條染色體上的4個SSR標記對F2群體中47株黃綠葉突變體進行連鎖分析（見表3），發現第3號染色體上的兩個標記RM3417和RM5513，與YGL4(t)座位之間的重組率均在 50%左右，表現為1∶2∶1的帶型分離，表明這兩個標記與YGL4(t)基因獨立遺傳，不存在連鎖關系。而位于第10染色體上的兩個標記，RM1162和RM7093與YGL4(t)座位之間的重組率分別為2.13%和4.26%，表明兩個標記與YGL4(t)座位緊密連鎖。利用Kosambi作圖函數計算，YGL4(t)與 RM1162和 RM7093的遺傳距離分別為 2.1 cM 與4.2 cM（見圖4）（cM為遺傳距離單位厘摩）。

表3 F2分離群體中黃綠葉突變體連鎖分析

圖4YGl4(t)的分子定位

2.5.4 實驗教學延伸

實驗結束后，教師要引導學生查詢文獻資料，了解水稻葉綠素突變體的專業分類。根據 Chla/Chlb的比值劃分為 Chlb-less型與 Chlb-deficient型兩類。Chlb-less型突變體的葉綠素 b含量極低，Chla/Chlb比值接近或超過20；Chlb-deficient型一般含一定量的葉綠素b，其Chla/Chlb比值在6～10之間[6]。然后根據專業分類標準推斷該材料的類型，本實驗結果表明，ygl4(t)突變體的葉綠素b含量極顯著低于WT，且突變體Chla/Chlb的比值超過20，但葉綠素a含量與WT差異不顯著，因此可以判斷該材料屬于典型的Chlb-less型突變體，其總葉綠素含量的降低主要是由于葉綠素b的下降所致。

在基因連鎖分析課堂教學中，教師要指導學生學會利用Gramene網站（www.gramene.org）查詢引物序列，并引導學生了解SSR的序列結構及其在基因連鎖分析中的重要作用。在獲得YGL4(t)基因的連鎖分析結果后，教師還需進一步指導學生利用水稻基因組RAP-DB網站（https://rapdb.dna.affrc.go.jp）對位于RM7093與RM1162標記區域的物理距離和基因組序列進行分析。可以發現，2個標記之間的物理距離約為400 kb（kb為物理距離單位千堿基對），并存在3個與葉綠素相關的基因：CHL-CPN10、CAO1和CAO2。在此基礎上，與學生進一步探討YGL4(t)基因的精細定位、基因克隆技術、功能分析等方法，延伸學生遺傳學知識的深度。

3 在實踐教學中的應用與思考

3.1 實驗安排

本實驗需要學生以5—6人為一組協作完成，并結合線上虛擬仿真實驗教學平臺和線下課堂教學、課程內實驗和課程外開放實驗進行，整個實驗總計5次課，每次課4學時。

1）第1次課。

介紹整個實驗的目的與內容，重點講解 EMS在科學研究中的應用，提供給學生ygl4(t)突變體和 J10野生型植株，先觀察葉色差異，再開展葉綠素含量測定實驗，通過數據對比引導學生提出科學問題。

2）第2次課。

在課堂上，先提問：如何構建適合ygl4(t)突變體的遺傳分析與基因連鎖分析群體？接著引導學生結合ygl4(t)和 J10的遺傳背景差異思考：用這兩個材料進行基因連鎖分析材料構建是否合適？再提供給學生ygl4(t)、J10、西農 1A、F1種子和 F2種子，結合田間拍攝群體構建時的視頻與圖片，向學生介紹本實驗提供的構建策略。引入遺傳背景差異較大的西農1A進行遺傳分析群體構建，并以此為基礎繪制出構建流程圖。然后結合虛擬仿真實驗，引導學生學習水稻雜交技術。后2學時，講解水稻育苗技術和遺傳分析方法等，并結合課程外開放實驗進行親本（ygl4(t)和西農1A）及F1、F2水稻種子浸種，以及其他育苗實驗（營養液配制、催芽、出苗）和遺傳分析等。

3）第3—5次課。

基因連鎖分析。該部分實驗分兩種情況，如果學生培養的F2群體生長很好，可以在三葉期時開展遺傳分析，并收集黃綠葉突變表型進行基因連鎖分析。如果學生因意外未獲得預期水稻苗，可以就此問題分析原因，并提供給學生在超低溫冰箱中提前備份好的水稻單株葉片用于遺傳分析與基因連鎖分析。本部分共安排3項實驗內容，在每次實驗之前，學生均需利用微課平臺的線上MOOC、儀器教程及實操視頻提前預習。①利用SDS法提取水稻葉片DNA。②利用4個SSR標記對 DNA模板進行聚合酶鏈式反應。要向學生講解 SSR序列結構及重要用途，使其學會使用Gramene網站查詢引物序列。③對PCR反應產物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，并記錄帶型和繪制連鎖遺傳圖。要使學生學會利用RAP-DB網站查詢標記區域的物理距離，了解基因組序列分析方法，并以葉色突變體為例，與學生探討基因精細定位、基因克隆技術、功能分析等方法，拓展學生遺傳學知識的深度和廣度。

3.2 對實踐教學問題的思考

教師既是科學研究的主體，也是實驗教學的主體，教師將研究成果應用于教學，是推動實驗教學改革的重要途徑。科學研究中的實驗材料豐富且有特色，實驗技術先進，研究內容綜合性、連續性強，以這些特殊研究材料為基礎，可以很好地將多種實驗內容及技術手段串聯到一條線上。這種具有前后關聯性和整體性的實驗設計，對培養學生的跨專業知識綜合應用能力及創新研究能力具有重要作用。例如，本實驗以黃綠葉突變體材料為基礎，還可進一步串聯發芽率測定、水稻生長區域測定、光合效率測定、候選基因克隆及RT-PCR等實驗內容。將一個完整的科學研究鏈條，通過截取、濃縮、拓展等方式，在一個實驗項目中展示出來，能夠幫助學生在已學過的多種知識間建立聯系，進而鍛煉學生的整合應用思維。

與此同時，本實驗的應用尚有四個問題值得探討。

（1）實驗周期。雖然學生在整個實驗過程中，能學到較多知識點，但對于當前的緊湊型學習方式來說，還是有明顯的時間緊迫感。通過加強不同專業實驗之間的聯系，將重復性的實驗整合到一個大的實驗項目中，是解決實驗時間緊張問題的有效途徑。

（2）葉綠素含量測定需用新鮮葉片，因此在上課之前，教師需將田間抽穗期材料移栽至實驗室內，這項工作對教師來說比較繁瑣。由于該材料為全生育期黃綠葉突變體，可根據實驗進度安排，在苗期進行葉綠素含量測定，這就大大提升了實驗的靈活性。

（3）基因連鎖分析涉及的實驗步驟較多，且易受群體基數影響。為了培養學生的科學研究精神，應將該部分內容與課程外開放實驗相結合，以滿足學生重復實驗的需求。

（4）在課堂教學中還需注重教學的層次性，即在綜合性實驗之外，需加強對研究性實驗的引導。該實驗并非止于基因連鎖分析，后續還涉及基因精細定位、候選基因克隆及功能分析等實驗內容。因此可引導學生利用類似的突變材料，結合開放實驗平臺，自行開展系統性的科學研究。學生通過“實驗設計—田間栽培—實驗室研究—數據整理與分析”的完整科研流程，可以實現自我科學研究能力和綜合應用能力的提升。