葛根素基于內質網蛋白核心/信號分子/C/EBP同源蛋白通路對脂多糖誘導成骨細胞骨保護素及核因子-κB受體mRNA表達的影響

王海珍，王麗娟，贠云飛

作者單位：1唐山市協和醫院中醫科，河北 唐山063000；2遷西縣人民醫院骨科，河北 唐山064300

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性厭氧菌細胞壁的主要成分，可引發機體炎癥；可打破骨吸收和骨沉積平衡狀態，導致骨喪失，最終引起牙槽骨病理性吸收，在牙周炎、根尖周炎等牙周病致病過程中發揮重要的調控作用。骨組織的代謝平衡是維持骨正常功能的關鍵，其通過成骨細胞和破骨細胞共同完成。LPS 可抑制成骨細胞骨保護素（osteoprotegerin，OPG）表達，促進核因子-κB 受體（receptoractivatorofnuclearfactor- κBligand，RANKL）表達，進而抑制成骨分化，減少骨形成；還可促進破骨細胞形成，增強骨吸收，最終導致骨代謝平衡向骨吸收偏移，影響骨組織正常功能。葛根素可使成骨細胞OPG 表達升高，RANKL 表達降低，促進成骨前體細胞的成骨分化，抑制破骨細胞形成及其活性，最終維持正常的骨代謝平衡，有效地預防去卵巢小鼠的骨質流失，促進子宮內胎鼠的骨形成，因此葛根素可能上調OPG mRNA 水平，下調RANKL mRNA 水平，減輕LPS 對成骨前體細胞成骨分化的抑制作用。內質網蛋白核心/信號分子/C/EBP 同源蛋白（GRP78/PERK/CHOP）是調節內質網應激的關鍵信號通路，在LPS 誘導的機體炎癥反應中發揮重要作用，抑制其表達，可抑制炎癥反應，降低破骨細胞生成及其活性，抑制成骨細胞凋亡，增強成骨活性，而葛根素可以抑制GRP78、PERK 表達，減輕內質網應激反應，因而推測下調GRP78/PERK/CHOP 通路可能是葛根素對抗LPS 對成骨前體細胞成骨分化抑制作用的作用機制，本文自2018年3 月至2019 年3 月通過以LPS 處理體外培養的MC3T3-E1 細胞，探討基于GRP78/PERK/CHOP 通路研究葛根素對LPS 誘導成骨細胞OPG 和RANKL mRNA表達的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

小鼠胚胎成骨細胞前體細胞MC3T3-E1 購自上海匹拓生物科技有限公司（貨號PT1485）；OPG、RANKL、成骨相關基因（Runx2）、骨橋蛋白（OPN）、骨鈣素（OCN）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；葛根素購自上海恒斐生物科技有限公司（貨號P9050）；4-苯基丁酸鈉鹽（4-Phenylbutyric acid，4-PBA）購自北京謹明生物科技有限公司（貨號：P10083）；DMEM 高糖培養基購自上海微科生物技術有限公司（貨號L0104-100）；LPS、胎牛血清（FBS）、PBS 緩沖液、胰蛋白酶-EDTA 消化液、100×青鏈霉素混合液、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒購自Solarbio 公 司（貨 號 分 別 為L8880、11011-8611、P1022、T1300、P1400、P1200-50T）；成骨誘導培養基購自百致生物醫藥科技（上海）有限公司（貨號biosmedi-DF-8001）；茜素紅染色液購自上海聯碩生物科技有限公司（貨號N/A-899）；RNAiso Plus、逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒購自日本Takara 公司（貨號分別為9108、RR037Q/A/B、639519）；兔源GAPDH、葡萄糖調節蛋白78（GRP78）、蛋白激酶R樣內質網激酶（PERK）及內質網應激蛋白（CHOP）一抗、羊抗兔二抗購自美國Abcam 公司（貨號分別為 ab181602、 ab21685、 ab229912、 ab179823、ab150077）；堿性磷酸酶檢測試劑盒、RIPA 裂解液、BCA 試劑盒購自上海碧云天公司（貨號分別為P0321、P0013K、P0011）等。

3900 型高通量DNA 合成儀購自美國應用生物系統公司；CFX96 Touch Deep Well 熒光定量PCR 儀購自美國Bio-Rad 公司；Elx800 酶標儀、1659001 蛋白電泳儀、Trans-Blot SD 半干轉膜儀購自美國Bio-Rad 公司；CKX41-F32F 光學顯微鏡購自日本Olympus 公司；Centrifuge 5424R 低溫高速離心機購自德國Eppendorf 股份公司等。

1.2 細胞模型制備及分組處理

完全培養基的配制：向DMEM 高糖培養基中加入10%胎牛血清、100 U/mL青鏈霉素，上下顛倒混勻即可。

將購買的凍存細胞株在39 ℃水浴中快速融化，1 000 r/min，室溫離心5 min，以完全培養基重懸后混勻，置于37 ℃，5%二氧化碳細胞培養箱中培養，細胞長至85%左右時，以胰蛋白酶消化，1∶3比例傳代，接種在4個24孔板中，繼續培養24 h。隨機數字表法分為對照組、模型組、4-PBA 組、葛根素組、葛根素+4-PBA 組，除對照組，其余各組參照文獻，以1 μg/mL LPS 處理MC3T3-E1 細胞24 h 建立成骨細胞炎癥模型，同時4-PBA 組細胞以1 mmol/L 4-PBA（以DMEM 高糖培養基溶解）處理，葛根素組細胞以10 nmol/L 葛根素（以DMEM 高糖培養基溶解）處理，葛根素+4-PBA 組細胞同時以1 mmol/L 4-PBA 及10 nmol/L 葛根素處理，繼續培養24 h，其中三板收集各組細胞備用，另一板收集各組細胞培養液后，細胞經PBS 漂洗后，以4%多聚甲醛溶液固定后備用。

1.3 各組細胞成骨分化檢測

1.3.1 茜素紅染色 取1.2 中4%多聚甲醛固定的一板細胞，每孔加入250 μL 茜素紅染色液，室溫孵育30 min，吸出染液，以PBS 漂洗后，在顯微鏡下觀察礦化結節染色情況，任取5個視野拍照，判定各組細胞礦化結節相對比例，對照組設為100%，礦化結節相對比例=實驗組礦化結節數/對照組礦化結節數×100%。

1.3.2 ALP活性檢測 取1.2中收集的一板細胞，加入蛋白裂解液后，冰浴中裂解1 h，3 000 r/min，4 ℃離心20 min，取上清液，使用ALP檢測試劑盒檢測各組細胞ALP活性水平，具體步驟參照說明書。

1.4 各組細胞培養基上清液中TNF-α、IL-6水平檢測

取1.2 中收集的各組細胞培養液，3 000 r/min，4 ℃離心15 min，取上清液，以ELISA 試劑盒檢測各組細胞培養基上清液中TNF-α、IL-6 水平，具體步驟參照說明書。

1.5 各組細胞Runx2、OPN、OCN、OPG、RANKL mRNA 水平檢測

取1.2 中收集的另一板細胞，加入RNAiso Plus，參照說明書的步驟提取總RNA，采用逆轉錄試劑盒將其逆轉錄為cDNA 后，以熒光定量PCR 試劑盒進行qRT-PCR 反應，每個樣品設3 個復孔取均值，反應體系的配制及反應條件的設定參照說明書，以GAPDH 做為內參基因，采用2算法對數據進行分析，目標基因和內參基因引物序列見表1。

1.6 各組細胞GRP78、PERK、CHOP 蛋白表達水平檢測

取1.2 中收集的最后一板細胞，加入蛋白裂解液后，冰浴中裂解1 h，3 000 r/min，4 ℃離心20 min，取上清液，參照說明書的操作步驟以BCA 試劑盒測定各組總蛋白濃度，根據目的蛋白分子量配制適宜濃度的SDS-PAGE 凝膠，取含相同質量總蛋白各組樣品液進行SDS-凝膠電泳，轉移蛋白至PVDF膜上，加入5%脫脂奶粉，室溫封閉2 h，截取蛋白條帶置于小盒中，分別加入兔源GRP78、PERK、CHOP、GAPDH 一抗，4 ℃，孵育過夜，以TBST 漂洗后，以羊抗兔二抗室溫孵育2 h，經TBST 漂洗后，以增強化學發光法顯色，凝膠成像儀拍攝圖片，并以Image J 軟件分析蛋白條帶，得出各組蛋白相對表達量。

表1 目標基因和內參基因引物序列

1.7 統計學方法

采用SPSS 24.0 軟件對數據進行統計分析，計數數據以率（%）表示；計量數據以x ± s表示，組間比較行單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組MC3T3-E1 細胞成骨分化檢測結果

與對照組相比，模型組MC3T3-E1 細胞礦化結節相對比例、ALP 活性明顯降低（P ＜0.05）。與模型組相比，4-PBA 組、葛根素組、葛根素+4-PBA 組MC3T3-E1 細胞礦化結節相對比例、ALP 活性均升高（P ＜0.05）。與4-PBA 組、葛根素組分別相比，葛根素+4-PBA 組MC3T3-E1 細胞礦化結節相對比例、ALP 活性均升高（P ＜0.05），4-PBA 組、葛根素組MC3T3-E1細胞礦化結節相對比例、ALP 活性相比差異無統計學意義（P ＞0.05），見圖1、表2。

2.2 各組MC3T3-E1細胞培養基上清液中TNF-α、IL-6 水平檢測結果

與對照組相比，模型組MC3T3-E1 細胞培養基上清液中TNF-α、IL-6 水平明顯升高（P ＜0.05）。與模型組相比，4-PBA組、葛根素組、葛根素+4-PBA組MC3T3-E1細胞培養基上清液中TNF-α、IL-6水平均降低（P ＜0.05）。與4-PBA組、葛根素組分別相比，葛根素+4-PBA組MC3T3-E1細胞培養基上清液中TNF-α、IL-6水平均降低（P ＜0.05），4-PBA組、葛根素組MC3T3-E1 細胞培養基上清液中TNF-α、IL-6水平比較差異無統計學意義（P ＞0.05），見表3。

2.3 各組MC3T3-E1 細胞成骨相關基因Runx2、OPN、OCN mRNA 水平檢測結果

與對照組相比，模型組MC3T3-E1 細胞Runx2、OPN、OCN mRNA 水平明顯降低（P ＜0.05）。與模型組相比，4-PBA組、葛根 素 組、葛根素+4-PBA 組MC3T3-E1 細胞Runx2、OPN、OCN mRNA 水平均升高（P ＜0.05）。與4-PBA組、葛根素組分別相比，葛根素+4-PBA 組MC3T3-E1細胞Runx2、OPN、OCN mRNA水平均升高（P ＜0.05），4-PBA組、葛根素組MC3T3-E1細胞Runx2、OPN、OCN mRNA 水平比較差異無統計學意義（P ＞0.05），見表4。

表2 各組MC3T3-E1細胞礦化結節相對比例、ALP活性比較/-x ± s

表3 各組MC3T3-E1細胞培養基上清液中TNF-α、IL-6水平比較/（pg/mL，x ± s）

2.4 各組MC3T3-E1 細胞OPG 及RANKL mRNA水平檢測結果

與對照組相比，模型組MC3T3-E1細胞OPG mRNA 水平明顯降低（P ＜0.05），RANKL mRNA 水平明顯升高（P ＜0.05）。與模型組相比，4-PBA組、葛根素組、葛根素+4-PBA組MC3T3-E1細胞OPG mRNA 水平均升高（P＜0.05），RANKL mRNA 水平均降低（P ＜0.05）。與4-PBA 組、葛根素組分別相比，葛根素+4-PBA 組MC3T3-E1 細胞OPG mRNA 水平均升高（P ＜0.05），RANKL mRNA 水平均降低（P ＜0.05），4-PBA 組、葛根素組MC3T3-E1 細胞OPG mRNA 水平及RANKL mRNA 水平比較差異無統計學意義（P ＞0.05），見表5。

表4 各組MC3T3-E1細胞成骨相關基因Runx2、OPN、OCNmRNA水平比較/x ± s

表5 各組MC3T3-E1細胞OPG及RANKL mRNA水平比較/x ± s

2.5 各組MC3T3-E1細胞GRP78/PERK/CHOP 通路蛋白表達水平檢測結果

與對照組相比，模型組MC3T3-E1 細胞GRP78、PERK、CHOP 蛋白表達水平明顯升高（P ＜0.05）。與模型組相比，4-PBA 組、葛根素組、葛根素+4-PBA 組MC3T3-E1 細胞GRP78、PERK、CHOP 蛋白表達水平均降低（P ＜0.05）。與4-PBA 組、葛根素組分別相比，葛根素+4-PBA 組MC3T3-E1 細胞GRP78、PERK、CHOP 蛋白表達水平均降低（P ＜0.05），4-PBA 組、葛根素組MC3T3-E1細胞GRP78、PERK、CHOP 蛋白表達水平比較差異無統計學意義（P ＞0.05），見圖2、表6。

3 討論

圖2 免疫印跡檢測MC3T3-E1細胞葡萄糖調節蛋白78（GRP78）、蛋白激酶R樣內質網激酶（PERK）及內質網應激蛋白（CHOP）蛋白表達水平情況

表6 各組MC3T3-E1細胞GRP78、PERK、CHOP蛋白相對表達/x ± s

在骨折、牙周炎等疾病中，LPS 誘導的炎癥反應可影響骨代謝，破壞成骨與破骨的動態平衡，抑制骨形成，促進骨吸收，造成骨折不愈合、牙槽骨的吸收萎縮等后遺癥，因此，抑制LPS 誘導的炎癥反應，減輕骨吸收，增強骨形成具有重要的臨床意義。RANKL 是成骨系細胞分泌的破骨細胞形成及激活調節因子，OPG 是其分泌的骨保護蛋白，能結合RANKL，減弱破骨細胞介導的骨吸收，LPS 通過下調OPG 表達，上調RANKL 表達，促進骨吸收，而葛根素可促進人成骨細胞分泌OPG，抑制RANKL 合成，進而增強骨形成，減輕骨吸收，是一種有效預防及延緩骨質疏松癥的藥物，因而葛根素可能通過促進OPG 表達，抑制RANKL 表達來拮抗LPS 對成骨前體細胞成骨分化的抑制作用。本研究結果顯示，模型組MC3T3-E1 細胞礦化結節相對比例、ALP活性、細胞Runx2、OPN、OCN 及OPG mRNA 水平明顯降低，細胞培養基上清液中TNF-α及IL-6水平、細胞RANKL mRNA 水平明顯升高，表明LPS可引起細胞炎癥反應，抑制OPG mRNA 表達，促進RANKL mRNA 表達，抑制成骨相關基因Runx2、OPN、OCN mRNA 表達，進而抑制成骨分化，揭示模型建立成功。模型細胞經葛根素處理后，MC3T3-E1 細胞礦化結節相對比例、ALP 活性、細胞Runx2、OPN、OCN及OPG mRNA 水平均升高，細胞培養基上清液中TNF-α 及IL-6 水平、細胞RANKL mRNA 水平均降低，表明葛根素可減輕細胞炎癥反應，逆轉LPS誘導的OPG mRNA 表達下調，RANKL mRNA 表達上調，進而拮抗LPS 對成骨分化的抑制，揭示葛根素可抑制LPS導致的骨吸收，維持骨代謝平衡。

由實驗結果可知，模型細胞GRP78、PERK、CHOP蛋白表達明顯升高，葛根素拮抗LPS作用的同時，可下調GRP78、PERK、CHOP 蛋白表達，揭示GRP78/PERK/CHOP通路可能是葛根素發揮作用的靶點。研究發現，GRP78/PERK/CHOP通路是調控內質網應激的主要信號，LPS 可引起內質網應激反應，上調GRP78/PERK/CHOP 信號表達，抑制內質網應激反應，下調GRP78/PERK/CHOP 通路表達，可促進成骨細胞增殖及分化，而在淀粉樣β誘導的視網膜色素上皮細胞炎癥反應中，葛根素可通過抑制ROS 表達，抑制內質網應激，因此推測抑制GRP78/PERK/CHOP信號通路可能是葛根素抑制LPS導致的骨吸收的作用機制。本研究結果顯示，以內質網應激抑制劑4-PBA 處理MC3T3-E1 細 胞，細 胞GRP78、PERK、CHOP 蛋白表達下調，其礦化結節相對比例、ALP 活性、細胞Runx2、OPN、OCN 及OPG mRNA 水平均升高，細胞培養基上清液中TNF-α 及IL-6 水平、細胞RANKL mRNA水平均降低，表明抑制GRP78、PERK、CHOP蛋白表達，4-PBA處理組與葛根素單用組上述各項結果比較差異無統計學意義，說明二者均可減輕細胞炎癥反應，逆轉LPS 誘導的OPG mRNA 水平降低，RANKL mRNA水平升高，進而減輕對成骨分化的抑制，以葛根素及4-PBA聯合處理MC3T3-E1細胞，使細胞礦化結節相對比例、ALP活性、細胞Runx2、OPN、OCN 及OPG mRNA 水平進一步升高，細胞培養基上清液中TNF-α及IL-6水平、細胞RANKL mRNA 水平及GRP78、PERK、CHOP 蛋白表達進一步降低，表明葛根素和4-PBA可協調抑制GRP78、PERK、CHOP蛋白表達、減輕細胞炎癥反應、拮抗LPS對成骨分化的抑制，對LPS 下調OPG mRNA 表達，上調RANKL mRNA 表達的逆轉作用更強，揭示葛根素上調OPG mRNA水平，下調RANKL mRNA水平，抑制LPS誘導的炎癥反應并拮抗其對成骨前體細胞成骨分化抑制的藥理機制可能是下調GRP78/PERK/CHOP通路。

總之，葛根素可減輕LPS誘導的細胞炎癥反應，逆轉LPS 下調OPG mRNA 表達，上調RANKL mRNA表達的作用，拮抗LPS對成骨分化的抑制，為臨床牙周病的治療提供了新的思路，下調GRP78/PERK/CHOP 通路，抑制內質網應激可能是其作用機制，但本研究未上調該通路進行對照驗證，還存在證據不全的缺點，需要進一步的深入研究。

（本文圖1見插圖2-1）