長鏈非編碼RNA GAS5、微小RNA-21在多囊卵巢綜合征中的表達及生物學意義

祁彥萍，王英，楊建敏

作者單位：南陽市中心醫院婦產科，河南 南陽473000

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是臨床常見的一種內分泌疾病，其主要臨床表現為月經稀發、多囊卵巢，已經影響育齡婦女生活質量。目前PCOS 發病機制尚未闡明，既往研究報道顯示PCOS 的發生過程涉及多種基因或信號通路。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）在PCOS 發生與發展過程中發揮重要調控作用，研究表明長鏈非編碼RNA GAS5（LncRNA GAS5）在PCOS 病人中呈低表達，并可能促進PCOS發生及發展。但關于GAS5 在PCOS 發生過程中的調控機制尚未闡明。生物信息學分析顯示微小RNA-21（microRNA-21，miR-21）可能是GAS5 的靶基因，研究表明miR-21在PCOS病人中呈高表達，其表達量與病人肥胖程度有關。本研究首先檢測PCOS 病人中GAS5與miR-21的表達水平，分析其與病人生化指標的相關性，通過原代培養卵巢顆粒細胞，探究GAS5 與miR-21 表達變化對細胞增殖及凋亡的影響，旨在為揭示PCOS 發病機制奠定理論基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017 年4月至2018 年10 月于南陽市中心醫院就診的50 例PCOS 病人為觀察組，年齡（28.46±5.49）歲，年齡范圍為23～35 歲，所有病人均符合荷蘭鹿特丹會議制定的PCOS 相關診斷標準中任意兩項：無排卵或稀發排卵；單側與雙側卵巢最大徑處于2～9 mm 之間的卵泡數超過12 個；高雄激素血癥。選取同時期本院收集的45 例非PCOS 病人為對照組，年齡（29.42±6.12）歲，年齡范圍為25～36 歲。所有病人均未服用降脂等藥物；未合并高血壓、糖尿病等相關疾病。所有病人知情且簽署同意書。兩組病人年齡、不孕年限、體質量指數（BMI）等指標相比差異無統計學意義（P ＞0.05），具有可比性。兩組臨床資料見表1。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》的相關要求。

1.2 材料與試劑

20只SD 雌性大鼠，清潔級，體質量范圍為200～230 g，購自凱學生物（上海），動物許可證號SCXK（滬）：2016-0009。Lipofectamine2000購自美國Thermo Fisher；Trizol試劑購自美國Invitrogen；pcDNA3.1購自上?？吕咨铮籥nti-miR-21、antimiR-NC、miR-21 mimics、miR-NC、si-GAS5、si-NC 購自廣州銳博生物；反轉錄試劑盒與實時熒光定量試劑盒均購自大連寶生物；CCK-8 購自弗元（上海）生物；細胞凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶；兔抗鼠Bax、Bcl-2 抗體購自美國CST；山羊抗兔二抗購自武漢艾美捷。

1.3 檢測病人臨床指標

所有病人均于月經期第2～5 天分別抽取空腹靜脈血5 mL，室溫條件下經3 000 r/min 轉速離心30 min，吸取上清置于EP 管內，放入-80 ℃超低溫冰箱保存。應用放射免疫法檢測總睪酮（TT）、雄烯二酮含量。采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清白細胞介素-18（IL-18）水平。

1.4 方法

1.4.1 原代培養卵巢顆粒細胞 大鼠經常規飼養2 d，將血清促性腺激素（40 IU）經皮下注射入小鼠體內，繼續培養48 h，采用頸椎脫臼法處死小鼠，切除卵巢組織，使用生理鹽水清洗，去除卵巢表面包膜及其周圍脂肪組織，生理鹽水清洗，將其置于不含血清的DMEM 培養基，使用注射針頭刺破卵泡釋放卵泡顆粒細胞，參照相關文獻操作培養卵泡顆粒細胞，待細胞生長密度至80%左右時進行傳代培養。

1.4.2 實驗分組 取生長狀態良好的卵泡顆粒細胞，分別將pcDNA、pcDNA-GAS5、anti-miR-NC、antimiR-21 轉染至卵泡顆粒細胞，分別命名為pcDNA組、pcDNA-GAS5組、anti-miR-NC組、anti-miR-21組，將未經轉染的卵泡顆粒細胞作為NC 組。轉染過程參照Lipofectamine2000說明書進行操作。各組細胞轉染后繼續培養48 h，收集對數期細胞進行后續實驗。

1.4.3 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測LncRNA GAS5、miR-21 的表達水平 采用Trizol 法提取血清中總RNA，應用分光光度計檢測RNA濃度與純度，按照反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，GAS5 以GAPDH 為內參，miR-21 以U6 為內參，置于ABI StepOneTM 實時熒光定量PCR 儀進行擴增。反應體系：qPCR Super Mix（2×）12.5 μL，cDNA 2 μL，正反向引物各1 μL，RNase-Free 雙蒸水補足體系至25 μL。反應條件：95 ℃5 min，95 ℃15 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共循環40 次。采用2法計算LncRNA GAS5、miR-21的相對表達量。

1.4.4 CCK-8 檢測細胞增殖 收集pcDNA 組、pcDNA-GAS5 組、anti-miR-NC 組、anti-miR-21 組、NC 組細胞接種于96 孔板（3×10個/孔），分別于培養24、48、72 h 時每孔分別加入10 μL CCK-8 試劑，37 ℃恒溫培養箱內培養4 h，應用酶標儀檢測各孔在450 nm波長時的吸光度值（OD）。

表1 多囊卵巢綜合征（PCOS）50例與非PCOS 45例一般臨床資料比較/x ± s

1.4.5

流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組卵巢顆粒細胞，0.25%胰蛋白酶消化，1 000 r/min 轉速離心6 min，棄上清，PBS 清洗，依次加入5 μL Annexin V-FITC 與5 μL PI，室 溫 避 光 孵 育10 min，置 于FACS Calibur 流式細胞儀及應用Cellauest 軟件檢測各組細胞凋亡。

1.4.6

雙熒光素酶報告基因檢測LncRNA GAS5 的靶基因 starbase 預測顯示LncRNA GAS5 與miR-21存在靶向關系，構建野生型載體WT-GAS5、突變型載體MUT-GAS5，分別將WT-GAS5、MUT-GAS5 與miR-NC、miR-21 mimics 共轉染至卵巢顆粒細胞參照熒光素酶活性檢測試劑盒分別檢測各組細胞熒光素酶活性。

1.4.7

蛋白質印跡法（Western Blot）檢測Bax、B 淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）蛋白表達 提取各組卵巢顆粒細胞總蛋白，取50 μg 蛋白樣品進行SDS-PAGE，轉膜，封閉，分別加入一抗稀釋液（1∶1 000）與二抗稀釋液（1∶2 000），TBST 洗滌，曝光，顯影，應用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.5 統計學方法

采用SPSS 21.0 統計學軟件分析數據，計量資料以x ± s 表示且均符合正態分布，兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多組之間兩兩比較采用SNK-q 檢驗的方法；采用Pearson法分析多囊卵巢綜合征病人中LncRNA GAS5 與miR-21 表達的相關性，以P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組臨床指標比較

與對照組相比，觀察組TT、雄烯二酮、IL-18水平明顯升高（P ＜0.05），見表2。

表2 多囊卵巢綜合征（PCOS）50例與非PCOS 45例臨床指標比較/x ± s

2.2 LncRNA GAS5、miR

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21 在多囊卵巢綜合征病人中的表達及其相關性分析

qRT-PCR 檢測結果顯示，觀察組病人血清中GAS5 的表達水平明顯低于對照組（P ＜0.05），miR-21 的表達水平明顯高于對照組（P ＜0.05），見表3。采用Pearson法分析多囊卵巢綜合征病人中GAS5 與miR-21 的相關性，結果顯 示GAS5 與miR-21 呈 負 相 關（r =-0.310，P =0.028），見圖1，表3。

表3 LncRNA GAS5、miR-21在多囊卵巢綜合征病人中的表達/x ± s

圖1 多囊卵巢綜合征病人中長鏈非編碼RNA（LncRNA）GAS5與微小RNA-21（miR-21）的相關性分析

2.3 LncRNA GAS5、miR

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21 表達與多囊卵巢綜合征病人臨床指標的相關性分析

采用Pearson 法分析多囊卵巢綜合征病人臨床指標與GAS5、miR-21的相關性，結果顯示，GAS5 與TT、IL-18 呈負相關（P ＜0.05），miR-21 與TT、雄烯二酮、IL-18 呈正相關（P ＜0.05），見表4。

表4 LncRNA GAS5、miR-21表達與多囊卵巢綜合征病人臨床指標的相關性分析

2.4 GAS5過表達對卵巢顆粒細胞增殖及凋亡的影響

實驗結果顯示，與pcDNA 組相比，pcDNA-GAS5組細胞活力顯著降低（P ＜0.05），細胞凋亡率顯著升高（P ＜0.05），Bax 蛋白相對表達量顯著升高（P ＜0.05），Bcl-2 蛋白相對表達量顯著降低（P ＜0.05），見表5。

2.5 GAS5靶向調控miR-21的表達

starBase 預測顯示GAS5 與miR-21 存在結合位點，見圖2。miR-21 過表達可降低WT-GAS5 的熒光素酶活性（P ＜0.05），而對MUT-GAS5 的熒光素酶活性無明顯影響，見表6。GAS5 可負向調控miR-21 的表達（P ＜0.05），見表7。

表5 GAS5過表達對卵巢顆粒細胞增殖及凋亡的影響（n=9）/x ± s

圖2 GAS5與miR-21存在結合位點

表6 雙熒光素酶報告實驗（n=9）/x ± s

表7 GAS5調控miR-21的表達（n=9）/x ± s

3 討論

LncRNA 在PCOS 病人中表達異常并可能參與PCOS 發生及發展過程。但仍有部分LncRNA 在PCOS 發生過程中的作用機制尚未可知。miRNA 可通過抑制靶基因表達從而參與PCOS 發生及發展過程。

GAS5 過表達可明顯降低心肌成纖維細胞增殖活力。本研究結果顯示GAS5 在PCOS 病人血清中表達下調，進一步研究顯示GAS5 與FSI、TT、IL-18、HOMA-IR呈負相關，提示GAS5表達量降低可能參與PCOS 發生與發展過程。研究表明卵巢顆粒細胞異常增殖是促進PCOS 發生的重要原因。本研究結果顯示GAS5 過表達后可顯著抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，Bax蛋白水平明顯升高，Bcl-2蛋白水平明顯降低，提示GAS5 過表達可能通過調控線粒體途徑抑制細胞凋亡。

miR-21 在PCOS 病人中表達上調，并可作為診斷PCOS 的分子標志物。miR-21 表達量升高可能促進PCOS 的高雄激素狀態的發生。與上述研究報道結果相似，本研究結果顯示PCOS 病人血清中miR-21的表達水平明顯升高，其高表達量與病人FBS、TT、雄烯二酮、IL-18、HOMA-IR 呈正相關，提示隨著miR-21 表達量的升高，PCOS 病人疾病嚴重程度越嚴重。同時本研究結果顯示PCOS 病人中GAS5 與miR-21 的表達量呈負相關，進一步通過熒光素酶報告實驗結果證實GAS5 可靶向結合miR-21，并可負向調控miR-21 的表達水平。提示GAS5過表達可能通過下調miR-21 表達從而促進卵巢顆粒細胞凋亡，抑制細胞增殖。

綜上所述，GAS5 表達量降低與miR-21 表達量升高可能參與PCOS 發生及發展過程，可能作為臨床診斷PCOS 的重要指標，GAS5 過表達可能通過抑制miR-21 表達降低卵巢顆粒細胞增殖能力及誘導細胞凋亡，可為PCOS分子靶向治療提供理論依據。