血腦屏障氧糖剝奪再灌體外模型小鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3中微小RNA-290b-3p的作用及機(jī)制研究

張奕雯，凡子蓮，李經(jīng)倫，熊蘭，趙自勝，李超

作者單位：1廣元市第一人民醫(yī)院，a神經(jīng)內(nèi)科，b放射科，四川 廣元628000；

2西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 瀘州646000

中風(fēng)是最具破壞性的疾病之一，排名為全世界死亡的第二大原因。中風(fēng)可分為缺血性中風(fēng)和出血性中風(fēng)。世界衛(wèi)生組織（WHO）將中風(fēng)定義為由腦血管病變導(dǎo)致的快速發(fā)展的腦功能局灶性或全局性紊亂的臨床癥狀，癥狀持續(xù)至少24 h，嚴(yán)重將導(dǎo)致死亡。缺血性中風(fēng)的核心事件是大腦組織的血液供應(yīng)中斷，進(jìn)一步導(dǎo)致缺氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏并加劇腦損傷。多年來(lái)，缺血性中風(fēng)過(guò)程中的病理機(jī)制如細(xì)胞凋亡、炎癥、氧化應(yīng)激和腦水腫等得到深入研究。然而，目前對(duì)于缺血性中風(fēng)的治療仍具有很大局限，缺乏具有特定功效的藥物。

血腦屏障破壞在缺血性中風(fēng)誘導(dǎo)的腦損傷中起關(guān)鍵作用。缺血性中風(fēng)引起的內(nèi)皮功能障礙，增加微血管通透性，導(dǎo)致血腦屏障滲漏，隨后引起腦水腫和出血性轉(zhuǎn)化，并促進(jìn)炎癥反應(yīng)，從而加重腦損傷。因此，在缺血期間保持血腦屏障完整性對(duì)中風(fēng)管理具有重要意義并且需要進(jìn)一步研究。最近的研究表明微小RNA（miRNA）可以調(diào)節(jié)各種中風(fēng)危險(xiǎn)因素和疾病前期機(jī)制，促進(jìn)或抑制miRNA 的表達(dá)可能有益于中風(fēng)后恢復(fù)。有關(guān)miRNA 在中風(fēng)后血腦屏障破壞的作用及機(jī)制尚不清楚。

本研究自2019 年3 月采用體外培養(yǎng)的小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株bEnd.3 細(xì)胞，氧糖剝奪再灌模型（oxygen and glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）模擬體內(nèi)腦中風(fēng)損傷，通過(guò)檢測(cè)miR-290b-3p 的表達(dá)以及抑制miR-290b-3p 對(duì)體外血腦屏障模型通透性的影響，探討miR-290b-3p 在體外氧糖剝奪模型下血腦屏障破壞的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株bEnd.3（ATCC 細(xì)胞庫(kù)），DMEM/F12 培養(yǎng)基（Sigma），胎牛血清（FBS）（杭州四季青），緊密連接蛋白5（Claudin-5）抗體（Proteintech），miR-290b-3p 特異性引物（（Ribo-Bio），miR-290b-3p抑制劑（吉瑪基因）。

1.2 方法

1.2.1

細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞系bEnd.3 在37 ℃細(xì)胞恒溫箱中孵育，DMEM/F12 補(bǔ)充有10%（V/V）的FBS，青霉素（100 U/mL）和鏈霉素（100 U/mL）。小鼠腦微血管內(nèi)皮bEnd.3 細(xì)胞在4～10 次傳代后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2

體外血腦屏障 bEnd.3 以2.5×10的密度接種到Transwell 小室內(nèi)腔（0.4 μm 孔徑）。使細(xì)胞生長(zhǎng)5 d 以實(shí)現(xiàn)匯合。為了評(píng)估細(xì)胞旁通透性，將熒光素異硫氰酸酯（FITC）-葡聚糖（70 kDa；Sigma-Aldrich）以1 μmol/L 的濃度添加到腔室中。在OGD 后1、2、3、4、6 h，使用來(lái)自下腔（外）室的30 μL 培養(yǎng)基，用熒光讀數(shù)器測(cè)量熒光強(qiáng)度，其中在每次測(cè)量前30 min 用新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基。樣品中示蹤劑的濃度由使用已知濃度的示蹤劑擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。確定示蹤劑從上腔室到下腔室的擴(kuò)散速率，表示為pmol·mm·min。

1.2.3

OGD/R 為了在體外模擬缺血，提前將bEnd.3細(xì)胞鋪板，接種到24孔板中。先吸去正常培養(yǎng)基，用PBS 清洗細(xì)胞兩次，加入無(wú)糖DMEM 培養(yǎng)基，24 孔板放入?yún)捬豕拗?。將厭氧罐放入恒溫?7 ℃）細(xì)胞培養(yǎng)箱中，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行缺糖、缺氧損傷。1 h 后復(fù)灌，換成正常培養(yǎng)基，放入恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)至設(shè)定時(shí)間參數(shù)，以供血腦屏障研究觀測(cè)使用。

1.2.4

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）測(cè)定 首先，使用TRIzol 試劑提取總RNA。然后，使用用于qPCR試劑盒（R133-01，Vazyme Biotech）逆轉(zhuǎn)錄miRNA-290b-3p。接下來(lái)，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)成熟miR-290b-3p的表達(dá)。

1.2.5

蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot） 在冰上使用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白。4 ℃，12 000 g離心20 min。BCA 蛋白定量。12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。用TBST 洗滌PVDF 膜3 次，每次15 min。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。加入一抗（claudin-5，1∶1 000），4 ℃過(guò)夜。用TBST 洗3 次，每次15 min。室溫孵育二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗，1∶2 000）2 h。用TBST 洗3 次，每次15 min。用化學(xué)發(fā)光顯色法顯影，拍照統(tǒng)計(jì)。

1.2.6

熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn) 根據(jù)Targetscan 軟件預(yù)測(cè)miR-290b-3p 與Claudin-5 mRNA 3’-UTR 區(qū)結(jié)合序列。將含該結(jié)合位點(diǎn)的片段插入到熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒。構(gòu)建兩組質(zhì)粒：包含該結(jié)合位點(diǎn)的野生型質(zhì)粒（Claudin-5 3’UTR WT）以及突變?cè)摻Y(jié)合位點(diǎn)的突變質(zhì)粒（Claudin-5 3’UTR Mut）。轉(zhuǎn)染bEnd.3 細(xì)胞miR-290b-3p（Robbio）和兩組質(zhì)粒，摩爾比為50∶1。miRNA 對(duì)照用作陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染后24 h 按照制造商的方案（Promega，E2920）進(jìn)行測(cè)定熒光素酶活性測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 軟件包進(jìn)行分析。觀測(cè)資料主要為計(jì)量數(shù)據(jù)，均通過(guò)正態(tài)性檢驗(yàn)。以x ± s 描述，兩組比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)或校正t 檢驗(yàn)。多時(shí)點(diǎn)資料比較為重復(fù)測(cè)量方差分析+組間LSD-t 檢驗(yàn)+組內(nèi)差值t 檢驗(yàn)。趨勢(shì)分析為計(jì)量資料行兩分類轉(zhuǎn)化后的Cochran Armitage 趨勢(shì)檢驗(yàn)。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外OGD/R 模型下血腦屏障通透性增加

構(gòu)建體外血腦屏障模型，見圖1。在OGD/R 后，血腦屏障在4 h 和6 h 遭到破壞，對(duì)FITC-葡聚糖通透性明顯增加，與對(duì)照組及與1 h 比較，各時(shí)間點(diǎn)FITC-葡聚糖（70 kDa）血腦屏障通透量均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 OGD/R后各時(shí)間點(diǎn)FITC-葡聚糖（70 kDa）血腦屏障通透性比較/（pmol·mm-2·min-1，x ± s）

此外，再以O(shè)GD/R 組FITC-葡聚糖（70 kDa）數(shù)據(jù)的總均值為界值，將OGD/R 組每個(gè)樣本轉(zhuǎn)化成兩分類計(jì)數(shù)資料，行Cochran Armitage 趨勢(shì)檢驗(yàn)，結(jié)果提示其通透性有隨時(shí)間增加的趨勢(shì)（χ=25.046，P ＜0.05）。

圖1 構(gòu)建體外血腦屏障模型

2.2 OGD/R 后miR

-

290b

-

3p 表達(dá)增加

在OGD/R后，小鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3 中miR-290b-3p 表達(dá)呈時(shí)間依賴性升高。與對(duì)照組及與1 h 比較，各時(shí)間點(diǎn)miR-290b-3p 表達(dá)量均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。見表2。

表2 OGD/R 后各時(shí)間點(diǎn)miR-290b-3p表達(dá)量比較/x ± s

2.3 miR-290b-3p與Claudin-5 mRNA 結(jié)合

利用miRNA 靶基因預(yù)測(cè)軟件Targetscan 預(yù)測(cè)出miR-290b-3p與Claudin-5直接結(jié)合，見圖2。熒光素酶實(shí)驗(yàn)miR-290b-3p與Clauldin-5 的結(jié)合，結(jié)果見表3。

2.4 敲低miR-290b-3p 緩解OGD/R 后血腦屏障的破壞

抑制OGD/R 后miR-290b-3p 的表達(dá)可以改善bEnd.3細(xì)胞OGD/R后Claudin-5的降低現(xiàn)象，并且抑制mi-290b-3p 的表達(dá)可降低體外血腦屏障模型對(duì)FITC-葡聚糖的通透性。結(jié)果圖3。

表3 miR-290b-3p與claudin-5結(jié)合數(shù)據(jù)/（n=6，x ± s）

圖2 miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件Targetscan預(yù)測(cè)miR-290b-3p與Claudin-5直接結(jié)合結(jié)果

圖3 敲低miR-290b-3p緩解OGD/R后血腦屏障破壞的條帶圖

3 討論

血腦屏障在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用，其可以將神經(jīng)系統(tǒng)與外周免疫系統(tǒng)分開，防止大腦受到有毒物質(zhì)的影響；同時(shí)，血腦屏障可以阻礙大分子物質(zhì)進(jìn)入腦內(nèi)。在缺血性腦損傷中，血腦屏障的通透性完整性遭到破壞，并誘導(dǎo)腦水腫，加重腦損傷。因此探究缺血性中風(fēng)后血腦屏障的損傷機(jī)制具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)OGD/R 后體外血腦屏障模型的通透性增加，并伴隨著miR-290b-3p 的表達(dá)增加。miRNA 是長(zhǎng)度約22 個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNA 分子，其通過(guò)與mRNA 分子的3′非翻譯區(qū)（UTR）結(jié)合并使促進(jìn)mRNA 降解或抑制它們的翻譯而充當(dāng)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)劑。miRNA分析技術(shù)（微陣列分析）在缺血性腦損傷中的應(yīng)用始于2008 年。研究發(fā)現(xiàn)miRNA 對(duì)腦缺血中下游靶基因具有潛在調(diào)節(jié)作用，從而在缺血性腦損傷中發(fā)揮重要作用。

Claudin-5 是血腦屏障中的緊密連接蛋白。大量研究表明，Claudin-5 可調(diào)節(jié)血腦屏障的完整性和通透性。并且Claudin-5表達(dá)的增加在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起著神經(jīng)保護(hù)作用，特別是在腦缺血性中風(fēng)中。此外，Claudin-5 可能是缺血性中風(fēng)早期出血性轉(zhuǎn)化檢測(cè)的潛在標(biāo)志物。介于Claudin-5在維持血腦屏障完整性和通透性中的重要作用，目前開發(fā)出藥物治療，激素治療，受體靶向，基因治療和物理治療等治療方法，旨在通過(guò)Claudin-5 調(diào)節(jié)血腦屏障達(dá)到治療缺血性中風(fēng)的目的。這些證據(jù)表明，Claudin-5 在缺血性中風(fēng)中對(duì)維持BBB 完整性起著重要作用。在缺血性腦中風(fēng)后，Claudin-5 的表達(dá)降低，這會(huì)導(dǎo)致BBB 的破壞，導(dǎo)致腦損傷加劇。然而，目前許多問(wèn)題仍未得到解決。例如，中風(fēng)后Claudin-5 表達(dá)降低的機(jī)制是什么？雖然前期有研究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬酶（MMP）可介導(dǎo)腦缺血后大鼠血腦屏障中claudin-5的破壞，但是腦中風(fēng)后Claudin-5 的破壞是否涉及其他機(jī)制仍需繼續(xù)研究。鑒于miRNA 在基因表達(dá)中調(diào)控作用，本研究通過(guò)miRNA靶基因預(yù)測(cè)及熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-290b-3p直接靶向Claudin-5。本研究發(fā)現(xiàn)miR-290b-3p 對(duì)Claudin-5 具有調(diào)節(jié)作用，下調(diào)OGD/R 后miR-290b-3p 的水平，Claudin-5 的表達(dá)增加，并且體外血腦屏障模型對(duì)FITC-葡聚糖的通透性降低，這表明下調(diào)miR-290b-3p 可促進(jìn)Claudin-5 的表達(dá)從而發(fā)揮血腦屏障保護(hù)作用。

本研究結(jié)果表明，小鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞bEnd3 中miR-290b-3p 在OGD/R 后表達(dá)增加，這會(huì)增加miR-290b-3p 與Claudin-5 mRNA 的結(jié)合，促進(jìn)Claudin-5 mRNA 的降解，這可能是Claudin-5 在OGD/R 后降低的原因之一。因此抑制OGD/R 后miR-290b-3p表達(dá)上調(diào)可通過(guò)增加Claudin-5 的表達(dá)來(lái)保護(hù)BBB 完整性。綜上，miR-290b-3p 可能作為預(yù)防中風(fēng)后BBB破壞的治療靶點(diǎn)。