幽門螺桿菌感染病兒胃黏膜組織微小RNA-497-3p表達及與Toll樣受體8/Toll樣受體10/核因子κB信號通路的相關性

彭丹，陳國強，董琳，陳霞

作者單位：1黃岡市中心醫院，a檢驗科，b兒科，湖北 黃岡438000；2湖北文理學院附屬醫院、襄陽市中心醫院兒科，湖北 襄陽441021

幽門螺桿菌（Helicobacterpylori，Hp）感染作為胃黏膜病變的主要致病因素，它能誘導胃黏膜上皮細胞的損傷，誘發胃炎、消化道潰瘍，并在胃癌的發生發展過程中起著重要作用。近年來，兒童的HP感染陽性率呈逐年上升趨勢，胃炎、胃潰瘍在兒童中的發病率也不斷升高。微小RNA（MicroRNAs，miRNA）是一類內源性的具有調控功能的非編碼RNA，它通過與特定mRNA 結合，影響轉錄過程，調控細胞的生理過程。許多研究表明，微小RNA 是一種非常重要的調控因子，參與炎癥、癌癥等多種疾病的調控。JI 等MicroRNA-132 通過靶向HT-22 神經細胞中的TRAF6，減輕脂多糖（LPS）誘導的炎癥損傷；Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）是一類模式識別受體（pattern-recognition receptor，PRRs），受病原體相關分子模式（PAMPs）的刺激，產生抗原觸發的先天和適應性免疫反應。最近的研究表明，免疫細胞中的TLR 激活可誘導多種小的調控RNA，稱為MicroRNAs，許多MicroRNA 可以通過積極或消極調節TLR 信號來控制炎癥過程和對感染的反應。Garo 等研究顯示，異常的miR-155表達參與了多種免疫過程，包括多種自身免疫性疾病和癌癥的發病機制。然而，miR-497-3p在Hp感染病兒胃黏膜組織中的表達情況以及作用機制尚不清楚。鑒于此，本研究通過檢測miR-497-3p 在Hp 感染病兒胃黏膜組織中的表達情況，分析其表達水平，探討其與核因子（NF）-κB 信號通路的相關性，以期為Hp感染致病機制的研究提供基礎資料。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014 年1月至2018 年11 月于黃岡市中心醫院就診的病兒210 例，其中男性120例，女性90例，年齡（10.54±3.21）歲，年齡范圍為4～14 歲。病兒經組織病理Hp 染色和C 尿素呼氣試驗檢查，將病兒分為Hp 感染組和Hp 非感染組。Hp感染組100 例，男58 例，女42 例，年齡（10.43±2.12）歲；Hp 非 感 染組110 例，男62 例，女48 例，年齡（10.25±2.56）歲，按其病因可分為飲食、藥物刺激和膽汁反流。兩組性別和年齡比較差異無統計學意義（P ＞0.05）。入選標準：有反酸、嘔吐、腹部不適、惡心、黑便或嘔血癥狀，且近2 個月無鉍劑、抗菌藥物、離子泵阻滯劑、激素、質子泵抑制劑使用史。排除標準：有心、肝、腎功能不全，營養不良，感染病，免疫系統和內分泌系統功能異常，惡性腫瘤。病兒及其監護人知情同意。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 試劑及儀器

RNA 提取試劑Trizol 購自美國Invitrogen 公司，逆轉錄試劑盒、SYBR Premix ExTaq試劑盒均購自日本TaKaRa 公司。miR-497-3p、Toll樣受體8（TLR8）、Toll 樣受體10（TLR10）、NF-κB mRNA 和內參GAPDH 引物設計及合成皆由上海生工生物公司設計完成。熒光PCR 檢測系統購自BIO-RAD（美國）。腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-8（IL-8）和白細胞介素-10（IL-10）ELISA 試劑盒購自Thermofisher 公司（美國）。

1.3 方法

1.3.1 標本采集 病兒行Hp 檢測及胃鏡檢查前需禁食6 h。Hp 檢測，病兒口服C 尿素膠囊，30 min行呼氣試驗。采用紅外線能譜儀檢測標本C 的原子峰值。病兒胃鏡檢查時，留取病兒胃竇部和胃黏膜組織置于-80 ℃冰箱用于聚合酶鏈式反應（PCR）檢測和酶聯免疫吸附測定（ELISA）。

1.3.2 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）實驗 采用qRT-PCR 方法檢測胃黏膜組織中miR-497-3p、TLR8、TLR10 和NF-Kb mRNA 的 表 達 水 平。用TRIzol 提取組織中的總RNA，取1 000 ng 總RNA，按照TaKaRa 試劑盒的說明書將其逆轉為cDNA。以逆轉好的cDNA 為轉錄模板，qRT-PCR 試劑盒和引物為試劑，按以下PCR 轉錄條件：預變性95 ℃30 s一個外循環；PCR 反應階段是40 個循環，每個循環為95 ℃5 s 和60 ℃30 s 進行PCR 擴增反應。結果GAPDH 作 為 內 參，采 用2法 計 算miR-497-3p、TLR8、TLR10和NF-κB mRNA的相對表達量。

miR-497-3p的引物序列為：

正向：5′-CAGCAGCACACUGUGGUUUGUA-3′

反向：5′-CAAACCACAGUGUGCUGCUGUU-3′

TLR8的引物序列為：

正向：5′-ATGTTCCTTCAGTCGTCAATGC-3′

反向：5′-TTGCTGCACTCTGCAATAACT-3′

TLR10的引物序列為：

正向：5′-GGTTCTTTTGCGTGATGGAATC-3′

反向：5′-GGTCGTCCCAGAGTAAATCAAC-3′

NF-Kb的引物序列為：

正向：5′-AACAGAGAGGATTTCGTTTCCG-3′

反向：5′-CCATCACGCAAAAGAACCCAG-3′

GAPDH的引物序列為：

正向：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′

反向：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′

1.3.3

ELISA 實驗 ELISA 實驗檢測病兒胃黏膜組織中的炎性因子的表達。將組織制備為勻漿，按照試劑盒的說明書，離心提取上清液，檢測黏膜組織中IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平。

1.4 統計學方法

實驗數據均采用SPSS 18.0 軟件進行統計學分析。觀測資料主要是計量數據，用x ± s表示，組間比較采用t檢驗，變量間相關性分析采用Pearson 相關分析，以P ＜0.01 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組miR-497-3p、TLR8、TLR10 和NF

-κ

B 表達水平比較

與Hp 非感染組比較，Hp 感染組胃黏膜組織中miR-497-3p水平下調，TLR8、TLR10和NFκB 水平均上調，均差異有統計學意義（P ＜0.05），見表1。

表1 幽門螺桿菌（Hp）感染組與Hp非感染組胃黏膜組織中miR-497-3p、TLR8、TLR10和NF-Kb表達水平比較/x ± s

2.2 兩組TNF-

α

、IL-6 、IL

-

8 和IL

-

10 表達水平比較

與Hp 非感染組比較，Hp 感染組胃黏膜組織中TNF-α、IL-6、IL-8 和IL-10 的水平均上調，均差異有統計學意義（P ＜0.05），見表2。

2.3 miRNA-497-3p 的表達水平用于診斷Hp 感染ROC 曲線

以Hp 感染組為陽性樣本（n= 100），以Hp 非感染組為陰性樣本（n = 110），再將miRNA-497-3p 指標水平劃分成7～8 個組段，建立接收者工作特征曲線（receiver operation characteristic，ROC）診斷分析模型。經ROC 分析知：miRNA-497-3p 診斷Hp感染的ROC 曲線下面積（AUC）為0.926（標準誤0.023，95%CI：0.824～0.912）。取1.025 為診斷Hp感染的臨界值，其相應的敏感度和特異度分別為91.8%和93.7%。

表2 幽門螺桿菌（Hp）感染組與Hp非感染組胃黏膜組織中TNF-α、IL-6、IL-8 和IL-10表達水平比較/x ± s

圖1 胃黏膜組織中miR-497-3p的ROC曲線

2.4 相關性分析

Hp 感染組胃黏膜組織中miR-497-3p 分別與TLR8、TLR10、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-8 和IL-10 的mRNA 水平呈 現 負相關性（r = -0.516，r=-0.492，r=-0.366，r=-0.342，r=-0.418，r=-0.406，r=-0.432，P ＜0.05）。

3 討論

Hp 是一級致癌因子，它與慢性胃炎、胃癌和消化性潰瘍等多種胃腸道疾病的發病密切相關。兒童是HP 感染的易感染人群，兒童感染Hp 后機體不能自然清除，不進行治療將會處于終身持續感染狀態。有研究表明Hp 感染能引起胃黏膜組織中炎性因子的變化導致疾病的發生。本研究結果顯示，Hp 感染組病兒胃黏膜組織中TNF-α、IL-6、IL-8 和IL-10水平均高于Hp非感染組，說明Hp感染病兒胃黏膜組織中炎性因子水平升高，可能是Hp 感染的一個致病因素。

MicroRNA（miRNA）是一類長度約為20～24 個核苷酸沒有編碼能力的微小RNA，在細胞內具有多種重要的調節作用，是基因表達的基本調控機制。近年來，許多研究表明，miRNA 在人類癌癥的發展、上皮-間質轉化和耐藥性中發揮重要作用。例如，miRNA 可以與信號通路相互作用，通過影響癌細胞遷移、侵襲、血管生成和增殖來調控腫瘤 轉 移。特 異 性miRNA 在Hp 感 染 組 織 中 表達，miRNAs 的異常表達在Hp 感染致病過程中起著關鍵性作用。研究顯示miR-24-3p 在胃黏膜病變早期表達較高，Hp 能在胃黏膜損傷早期參與miR-24-3p 的調控，使miR-24-3p 在胃黏膜組織中的表達減少，導致胃黏膜病變加重。Xie 等研究發現miR-152 和miR-200b 靶向調控B7-H1 的表達促進胃癌的發生發展。Li 等研究證明MicroRNA-187 通過抑制FOXA2，從而促進胃癌的發生和發展。本研究實時定量PCR 結果顯示Hp 感染組胃黏膜組織中miR-497-3p mRNA 表達量低于Hp 非感 染 組，說 明miR-497-3p 可能參 與了Hp 感染的致病過程。

HP感染與慢性胃炎、胃癌和消化性潰瘍等多種胃腸道疾病的發病密切相關。經Targetscan 網站預測miR-497-3p 的靶基因有TLR8、TLR10。而TLR8、TLR10 是Toll 樣受體家族成員，而Toll 樣受體家族是調控機體炎性反應的重要通路，在促進炎性反應及多種炎性因子釋放中發揮重要作用。Young 等研究顯示miR-21 可作為TLR8 的內源性配體，激活TRL8，促進系統性紅斑狼瘡（SLE）的發病。Hp可激活TLR10，促進IL-8 和TNF 炎性因子的分泌。本研究結果顯示，Hp 感染組胃黏膜組織中TLR8、TLR10 和NF-κB mRNA 相對表達量均高于Hp 非感染組，說明TLR8/TLR10/NF-κB 信號通路可能參與Hp 感染致病過程。相關分析結果顯示，Hp 感染組胃黏膜組織中miR-497-3p 相對表達量與TLR8、TLR10 mRNA 和NF-κB mRNA 相對表達量，IL-6、IL-8、IL-10 和TNF-α 水平均呈負相關，進一步說明miR-497-3p 可能通過調控TLR8/TLR10/NF-κB 信號通路介導的炎性反應而在Hp 感染致病過程中發揮重要作用。

綜上所述，miR-497-3p在Hp感染病兒的胃黏膜組織中的異常低表達，其可能是通過影響TLR8/TLR10/NF-κB 信號通路介導的炎性反應，從而在Hp感染的致病過程中發揮作用，可為臨床下一步的治療提供思路。但是影響病兒Hp 感染的因素很多，其具體的發病機制及診斷尚需進一步深入研究，且在接下來的工作中會重點探討miR-497-3p 影響病兒Hp感染具體的分子機制。