呼吸道合胞病毒下呼吸道感染病兒外周血微小RNA-145表達與T淋巴細胞亞群的關(guān)系

吳振奎，鐘麗花，林則彬，王家文

作者單位：1海南現(xiàn)代婦女兒童醫(yī)院兒科，海南 海口571100；

2海南省兒童醫(yī)院兒科，海南 海口571100

呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）是嬰幼兒下呼吸道感染的主要病原體之一。臨床表現(xiàn)為高熱、呼吸困難等癥狀，可引起肺炎、毛細支氣管炎，尤其是肺炎，嚴重影響嬰幼兒身心健康成長。因此，探討與RSV 下呼吸道感染肺炎發(fā)病相關(guān)因子具有重要臨床意義。T 淋巴細胞亞群CD3、CD4、CD8、CD4/CD8等在發(fā)揮免疫功能及維持免疫平衡中起關(guān)鍵作用，研究發(fā)現(xiàn)T 淋巴細胞免疫功能失調(diào)參與RSV 下呼吸道感染肺炎病情進展。而微小RNA-145（MicroRNA-145，mir-145）是目前呼吸系統(tǒng)疾病中研究較多的微小RNA（MicroRNA，miRNA）家族成員之一，其水平異常變化在機體免疫反應中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，參與多種疾病發(fā)生、發(fā)展。但mir-145 與RSV 下呼吸道感染肺炎發(fā)病及其T淋巴細胞亞群的關(guān)系尚不十分明確。鑒于此，本研究通過檢測RSV 下呼吸道感染肺炎病兒外周血血漿中mir-145表達，分析其與外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中T淋巴細胞亞群CD3、CD4、CD8水平及CD4/CD8值關(guān)系，以期為臨床治療RSV 下呼吸道感染肺炎提供新思路。結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017 年1月至2018 年12 月海南現(xiàn)代婦女兒童醫(yī)院兒科收治的RSV 下呼吸道感染肺炎病兒126 例作為RSV 肺炎組。入選標準：①均符合RSV 下呼吸道感染肺炎相關(guān)診斷標準；②RSV 檢測陽性；③均為急性發(fā)病；④臨床資料完整齊全。排除標準：①合并支氣管哮喘、肺結(jié)核等其他呼吸系統(tǒng)疾病；②入組前接受糖皮質(zhì)激素類或抗菌藥物治療；③伴有喉軟骨及肺發(fā)育不良；④合并先天性心臟病。RSV肺炎組病兒男性69例、女性57例，年齡（9.87±3.28）月，年齡范圍為30 d至15個月。另選取同期在海南現(xiàn)代婦女兒童醫(yī)院進行體檢的健康兒童130例作為健康對照組，心肺無異常，且無呼吸道感染病史，其中男性71 例、女性59 例，年齡（10.24±3.40）月，年齡范圍為30 d 至15 月。RSV 肺炎組病兒根據(jù)病情嚴重程度分為輕度組（n=54）、重度組（n=72），其中輕度組男性30 例、女性24 例，年齡（9.68±3.17）月，年齡范圍為30 d 至14 月；重度組男性39 例、女性33 例，年齡（9.94±3.20）月，年齡范圍為30 d 至15 月。并依據(jù)重度組病兒是否給予機械通氣分為非機械通氣組（n = 38）、機械通氣組（n=34），其中非機械通氣組男性21 例、女性17 例，年齡（9.73±3.22）月，年齡范圍為30 d～15 月；機械通氣組男性18 例、女性16 例，年齡（9.50±3.14）月，年齡范圍為30 d至15月。病兒近親屬均簽署《知情同意書》。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。同時，健康對照組與RSV 肺炎組、輕度組與重度組、非機械通氣組與機械通氣組基本資料相比，均差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見表1～3。

表1 健康對照組與呼吸道合胞病毒（RSV）肺炎組基線資料比較

表2 呼吸道合胞病毒（RSV）肺炎輕度組與重度組基線資料比較

1.2 方法

1.2.1 標本收集 分別抽取健康對照組和RSV 肺炎組病兒外周靜脈血4 mL。取2 mL 使用乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K）抗凝，室溫靜置30 min 后離心（3 000 r/min）10 min，分離獲取血漿，并儲存于-80 ℃低溫環(huán)境中，用于檢測血漿mir-145 表達水平。另2 mL EDTA-K抗凝后，使用Ficoll-Hypaque分離液（購自無錫華精生物科技有限公司）分離提取PBMC，用于檢測T 淋巴細胞亞群CD3、CD4、CD8水平及CD4/CD8值。

表3 重度呼吸道合胞病毒（RSV）肺炎非機械通氣組與機械通氣組基線資料比較

1.2.2

血漿mir-145 表達水平檢測 利用實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）檢測血漿mir-145表達水平。按照Trizol試劑盒（購自沈陽萬類生物科技有限公司）說明書提取血漿中總RNA，并依據(jù)PrimeScriptRT試劑盒（購自杭州主諾生物技術(shù)有限公司）中方法合成cDNA 鏈。以U6 為mir-145內(nèi)參進行擴增，引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。mir-145正向引物為5′-CCTCACGGTCCAGTTTTCCC-3′，反向引物為5′-GCAAATCCAGCTGTGAAACCA-3′；內(nèi)參U6正向引物為5′-GTGGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向引物為5′-GTAACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。反應條件為：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。所有反應均重復3次，完成后獲得Ct平均值，并用2計算血漿mir-145相對表達量。

1.2.3

PBMC 中T 淋巴細胞亞群檢測 使用BD FACSCalibur型流式細胞儀及配套試劑盒（購自北京德利卡生物技術(shù)有限公司）檢測PBMC 中T 淋巴細胞亞群CD3、CD4、CD8水平，并用MRFlow 流式細胞分析軟件自動行CD3、CD4、CD8絕對計數(shù)，同時計算CD4/CD8值。

1.3 統(tǒng)計學方法

運用SPSS 20.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料采用率（%）進行統(tǒng)計描述，行χ檢驗；計量資料（血漿mir-145 表達及PBMC 中CD3水平等）均符合正態(tài)分布和方差齊性檢驗，采用x ± s 進行統(tǒng)計描述，行t 檢驗。采用Pearson 檢驗分析RSV 肺炎病兒血漿mir-145 表達與PBMC 中T淋巴細胞亞群水平的相關(guān)關(guān)系。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 健康對照組與RSV 肺炎組血漿mir

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145 表達及PBMC 中T 淋巴細胞亞群水平比較

RSV 肺炎組病兒血漿mir-145 表達及PBMC 中CD8水平均明顯高于健康對照組（P ＜0.05），PBMC 中CD3、CD4水平及CD4/CD8值均顯著低于健康對照組（P ＜0.05）。見表4。

2.2 不同程度RSV 肺炎病兒血漿mir

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145 表達及PBMC 中T 淋巴細胞亞群水平比較

重度組病兒血漿mir-145 表達及PBMC 中CD8水平均顯著高于輕度組病兒（P ＜0.05），PBMC 中CD3、CD4水平及CD4/CD8值均明顯低于輕度組病兒（P ＜0.05）。見表5。

2.3 重度RSV肺炎非機械通氣組與機械通氣組病兒血漿mir-145 表達及PBMC 中T 淋巴細胞亞群水平比較

重度RSV肺炎機械通氣組病兒血漿mir-145表達及PBMC中CD8水平均明顯高于非機械通氣組病兒（P ＜0.05），PBMC 中CD3、CD4水平及CD4/CD8值均顯著低于非機械通氣組病兒（P ＜0.05）。見表6。

表4 健康對照組與呼吸道合胞病毒（RSV）肺炎組血漿微小RNA-145（mir-145）表達及外周血單個核細胞（PBMC）中T淋巴細胞亞群水平比較/x ± s

表5 不同程度呼吸道合胞病毒（RSV）肺炎病兒血漿微小RNA-145（mir-145）表達及外周血單個核細胞（PBMC）中T淋巴細胞亞群水平比較/x ± s

表6 重度呼吸道合胞病毒（RSV）肺炎非機械通氣組與機械通氣組病兒血漿微小RNA-145（mir-145）表達及外周血單個核細胞（PBMC）中T淋巴細胞亞群水平比較/x ± s

2.4 RSV 肺炎病兒血漿mir

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145 表達與PBMC 中T 淋巴細胞亞群水平的相關(guān)性

RSV 肺炎病兒血漿mir-145 表達與PBMC 中CD3水平呈負相關(guān)（r = -0.594，P ＜0.05），與PBMC 中CD4水平呈負相關(guān)（r-0.620，P ＜0.05），與PBMC 中CD8水平呈正相關(guān)（r0.657，P ＜0.05），與CD4/CD8值呈負相關(guān)（r = -0.633，P ＜0.05）。見圖1。

3 討論

近年來，因RSV 引起下呼吸道感染肺炎住院的嬰幼兒越來越多，若治療不及時，易發(fā)展為重癥肺炎，甚至可導致心力衰竭，危及病兒生命安全。因此尋找用于早期判斷RSV 下呼吸道感染肺炎病情程度的生物標記物至關(guān)重要。本研究選取外周血血漿中mir-145作為觀察項目，探討其與T 淋巴細胞亞群的關(guān)系，以期為早期防治RSV 下呼吸道感染肺炎提供有力依據(jù)。

圖1 呼吸道合胞病毒（RSV）肺炎病兒血漿微小RNA-145（mir-145）表達與外周血單個核細胞（PBMC）中T淋巴細胞亞群水平的相關(guān)性

miRNA是一類內(nèi)源性非編碼RNA分子，可通過降解靶基因mRNA 或抑制其翻譯，參與免疫反應調(diào)控等一系列過程。研究證實，miRNA 在多種呼吸系統(tǒng)疾病中起重要作用，如mir-145。mir-145是一種高度保守的miRNA，定位于人染色體5q32-33，其在T 淋巴細胞生成、發(fā)育中起重要調(diào)控作用。Qiu等研究報道，哮喘發(fā)病與淋巴細胞中輔助性T 細胞1（T helper cell 1，Th1）/輔助性T 細胞2（T helper cell 2，Th2）的平衡密切相關(guān)。且Fan 等研究發(fā)現(xiàn)，外周血mir-145 表達水平可通過靶向哮喘患者Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3（Runt-related transcription factor 3，Runx3）調(diào)節(jié)Th1/Th2 平衡，可作為診斷和治療哮喘的生物標志物。T 淋巴細胞是維持機體正常免疫功能的重要亞群，可分為CD4、CD8兩大亞群，CD4細胞活化后主要分為Th1、Th2 兩種類型，而Th1/Th2 平衡失調(diào)在肺炎發(fā)病過程中具有重要意義。CD3可用于評估細胞免疫的總體水平，CD4/CD8值可反映機體免疫穩(wěn)態(tài)情況。正常情況下，T 淋巴細胞亞群間相互作用，穩(wěn)定調(diào)節(jié)機體免疫功能。徐暢等研究發(fā)現(xiàn)，外周血CD3、CD4、CD8 水平及CD4/CD8 值變化與哮喘病兒過敏原類型有關(guān)，在哮喘發(fā)病過程中起重要作用。游正銘研究報道，監(jiān)測重癥肺炎患者淋巴細胞亞群（CD3等）水平，有利于臨床治療重癥肺炎和判斷預后。此外，梁導艷等研究發(fā)現(xiàn)，支原體肺炎病兒CD3水平、CD4/CD8 值遠低于健康對照組，可作為反映免疫功能狀態(tài)的有效指標。

本研究中，RSV肺炎組病兒血漿mir-145表達及PBMC 中CD8水平均遠高于健康對照組，PBMC 中CD3、CD4水平及CD4/CD8值均遠低于健康對照組，與梁導艷等研究結(jié)果類似，提示外周血血漿中mir-145 表達及PBMC 中T 淋巴細胞亞群CD3、CD4、CD8水平、CD4/CD8值異常可能與RSV 下呼吸道感染肺炎發(fā)病有關(guān)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，重度組病兒血漿mir-145 表達及PBMC 中CD8水平均遠高于輕度組病兒，PBMC 中CD3、CD4水平及CD4/CD8值均遠低于輕度組病兒，提示外周血血漿中mir-145 表達異常升高及T 淋巴細胞亞群異常可能參與RSV 下呼吸道感染肺炎病兒病情進展。本研究還發(fā)現(xiàn)，重度RSV 肺炎機械通氣組病兒血漿mir-145 表達及PBMC 中CD8水平均遠高于非機械通氣組病兒，PBMC 中CD3、CD4水平及CD4/CD8值均遠低于非機械通氣組病兒，提示臨床通過監(jiān)測上述參數(shù)變化，可能有利于評估RSV 下呼吸道感染肺炎病兒病情嚴重程度，對早期治療RSV 下呼吸道感染肺炎具有臨床意義。此外，本研究Pearson檢驗分析發(fā) 現(xiàn)，RSV 肺 炎病 兒血 漿mir-145 表 達與PBMC 中CD3水平呈負相關(guān)，與PBMC 中CD4水平呈負相關(guān)，與PBMC 中CD8水平呈正相關(guān)，與CD4/CD8值呈負相關(guān)，推測外周血血漿中mir-145表達參與RSV下呼吸道感染肺炎發(fā)生、發(fā)展，可能與PBMC 中T 淋巴細胞亞群CD3、CD4、CD8水平及CD4/CD8值異常變化有關(guān)。

綜上所述，外周血血漿中mir-145 表達水平在RSV 下呼吸道感染肺炎病兒中明顯升高，其水平變化可能與T 淋巴細胞亞群CD8水平異常升高，CD3、CD4水平及CD4/CD8值異常降低有關(guān)，提示監(jiān)測上述參數(shù)變化可能有助于早期防治RSV 下呼吸道感染肺炎。本研究僅初步探討RSV 下呼吸道感染肺炎病兒外周血血漿中mir-145 表達與T 淋巴細胞亞群的關(guān)系，下一步應增加樣本繼續(xù)進行研究。