慢性乙型肝炎病人外周血單個核細胞內微小RNA-155、核苷酸結合寡聚化結構域樣3表達與乙型肝炎病毒DNA載量的相關性

劉宏偉，王玉華

作者單位：1滄州市傳染病醫院肝病科，河北 滄州061001；2滄州市人民醫院檢驗科，河北 滄州061001

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是一種嗜肝性雙鏈DNA 病毒，其生物活性及復制水平受各種因素影響，HBV 感染可導致急性或慢性肝炎，是引起肝纖維化、肝硬化、肝癌的獨立危險因素。研究發現HBV 基因組X 區編碼的乙型肝炎病毒X 蛋白（HBx）及其羧基端截斷體在HBV 相關性肝炎發展為肝細胞癌過程中發揮重要作用。微小RNA-155（MicroRNA-155，Mir-155）是一個多功能miRNA，可介導炎癥反應，呈遞抗原，調控免疫過程中細胞因子生成等，與變應性鼻炎、慢性乙型肝炎（CHB）等多種炎癥性疾病及肝癌有關。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain like receptor protein 3，NLRP3）屬于NOD 樣受體分子，作為固有免疫重要組分在機體免疫及疾病發生發展中發揮重要作用，主要由HBx蛋白與線粒體外孔蛋白結合后活性氧水平增加激活，與糖尿病合并慢性牙周炎、系統性紅斑狼瘡、肝癌等疾病有關。然而關于Mir-155 聯合NLRP3與CHB 的關系尚鮮有報道，因此本研究擬通過檢測CHB 病人外周靜脈血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）Mir-155、NLRP3 水平，擬探究其與HBV-DNA 載量的關系及其可能機制，以期為CHB病人靶向治療提高一定理論參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017 年6 月至2019 年9 月滄州市傳染病醫院收治經肝臟病理活檢證實CHB 病人118 例為CHB 組，男性65 例，女性53 例，年齡（58.29±13.21）歲，年齡范圍為22～70 歲，其中HBVDNA ＜1×10拷貝/毫升（低載量組）51 例，1×10拷貝/毫升HBV-DNA ≤1×10拷貝/毫升（中載量組）38例，HBV-DNA ＞1×10拷貝/毫升（高載量組）29例，e抗原陽性病人57 例，e 抗原陰性病人61 例；穿刺肝組織病理診斷按照慢性肝炎炎癥分級分為G2 級51例，G3 級32 例，G4 級35 例；按照肝纖維化分期分為S2 期56 例，S3 期39 例，S4 期23 例。另選取同期門診健康體檢者118 例為健康對照組，男性61 例，女性57 例，年齡（56.14±12.36）歲，年齡范圍為22～73歲。兩組性別、年齡比較差異無統計學意義（P ＞0.05），具有可比性。本研究經過滄州市傳染病醫院道德倫理委員會批準通過，批準文號1710021，符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》。收集所有受試者臨床檢查資料，所有樣品采集及資料調查均取得病人及其近親屬知情同意并簽字確認。

1.2 納入及排除標準

納入標準：（1）符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015版）》關于CHB診斷標準；（2）均為HBV 感染型肝炎病人；（3）血液樣品采集前未接受任何保肝降酶等藥物治療；（4）均自愿配合本次調查研究者。

排除標準：（1）合并非酒精性脂肪肝、其他類型肝炎病毒感染、肝癌或其他惡性腫瘤者；（2）妊娠或哺乳期婦女；（3）合并心、肺、腎等臟器功能障礙者；（4）合并自身免疫性疾病者；（5）臨床資料不完整者。

1.3 方法

1.3.1 試劑及主要儀器 RNA 提取試劑盒（編號R0011）購自上海碧云天有限公司；淋巴細胞分離液（貨號abs930）購自上海愛必信生物科技有限公司；PrimeScript?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit（貨號6210A）、microRNA 定量（qRT-PCR）試劑盒（編號638314）、TB Green? Premix Ex Taq?Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（編號RR820A）均購自大連寶生物科技有限公司；引物由上海吉瑪生物科技有限公司合成；蛋白抽提試劑盒（批號P0028）、BCA 蛋白定量試劑盒（批號P0010S），購自上海碧云天有限公司；人IL-1β試劑盒（貨號BMS213HS）、人IL-18 ELISA 試劑盒（貨號KMC0181）、兔源一抗NLRP3 抗體（貨號PA5-20838）、GAPDH 抗體（貨號TAB1001），二抗羊抗兔IgG（貨號A32731）購自美國Invitrogen。MODEL550型酶標儀、7300 RT-qPCR儀（美國Bio-Rad公司）等。

1.3.2 標本采集 收集所有受試者清晨空腹外周靜脈血6 mL，分兩份保存，每份3 mL，其中一份添加淋巴細胞分離液提取PBMC，具體步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。另一份于室溫下3 000 r/min（有效離心半徑5 cm）離心15 min分離血清。兩份采集標本立即送檢或置于-80 ℃冰箱保存待檢。

1.3.3 血清HBV-DNA 載量檢測 采用實時定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）檢測血清HBV-DNA載量。

1.3.4 PBMC 中Mir-155、NLRP3 mRNA 水平 采用RNA 提取試劑盒提取PBMC 總RNA，反轉錄得cDNA 置于-20 ℃保存備用。采用RT-qPCR 法對Mir-155、NLRP3 mRNA 進行擴增。反應體系共25 μL：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（2×）/TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（2×）12.5 μL，cDNA（50 ng/μL）2 μL，上反向引物（10 μmol/L）各1 μL，雙蒸水8.5 μL。反應條件：95 ℃，5 s；95 ℃，30 s；60 ℃，30 s；72 ℃，15 s；40 個循環；添加溶解曲線。Mir-155 正向引物序列（5′→3′）為：TTA ATG CTA ATC GTG ATA GGG GT，反向引物序列（5′→3′）為：CCT TAA AAC TCC ACT AGA AGC A；NLRP3 mRNA 正向引物序列（5′→3′）為：CGT GAG TCC CAT TAA GAT GGA GT，反向引物序列（5′→3′）為：CCC GAC AGT GGA TAT AGA ACA GA-3；內參U6 正向引物序列（5′→3′）為：GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAA T，反向引物序列（5′→3′）為：CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT；GAPDH 正向引物序列（5′→3′）為：GTC GAT GGC TAG TCG TAG CAT CGA T；反向引物序列（5′→3′）為：TGC TAG CTG GCA TGC CCG ATC GAT C。 PBMC Mir-155、NLRP3 mRNA相對表達水平采用2法進行分析。

1.3.5

PBMC 中NLRP3 蛋白表達水平 采用免疫印跡（Western blot，WB）檢測PBMC 中NLRP3 蛋白表達。采用蛋白抽提試劑盒提取PBMC 總蛋白，BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，置于-80 ℃保存備用。取適量蛋白樣品于80 mV 電壓下6%SDS-PAGE 電泳2 h，250 mA 下PVDF 膜轉膜70 min。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入適量含2%脫脂奶粉的PBS 稀釋，加NLRP3（1∶200）及健康對照GAPDH 抗體（0.5 μg/mL）4 ℃孵育過夜，TBST 緩沖液洗膜3 次，每次20 min，用適量含2%脫脂奶粉的PBS 稀釋辣根過氧化物酶標記的二抗IgG（1∶5 000）室溫孵育1.5 h，按上述方法洗膜，顯色，曝片，觀察并分析結果。

1.3.6

血清IL-1β、IL-18 水平檢測 采用酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELLSA）檢測血清白細胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素-18（IL-18）水平，具體步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0 軟件進行統計分析。正態分布計量資料以x ± s表示，兩組間比較用t 檢驗，多組比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA 檢驗），進一步兩兩比較采用SNK-q 檢驗；計數資料用例（%）表示，兩兩比較采用χ檢驗。采用Pearson 法分析PBMC 中Mir-155、NLRP3 mRNA及其血清IL-1β、IL-18水平的相關性。P ＜0.05為差異有統計學意義。

表1 CHB病人與健康對照組一般資料比較

2 結果

2.1 兩組一般資料比較

兩組性別、年齡比較差異無統計學意義（P ＞0.05），與健康對照組比較，CHB組血清肝功能指標天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、PBMC 中Mir-155、NLRP3 mRNA 水平均顯著升高，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表1。

2.2 不同HBV-DNA載量CHB病人PBMC 中Mir

-

155、NLRP3 水平比較

與HBV-DNA 低載量組比較，中、高載量組CHB 病人PBMC 中Mir-155、NLRP3 mRNA 及蛋白水平依次增加，均差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表2，圖1。

圖1 不同HBV-DNA載量CHB病人PBMC中NLRP3蛋白表達

表2 不同HBV-DNA載量CHB病人外周靜脈血單個核細胞（PBMC）中Mir-155、NLRP3水平比較/x ± s

2.3 不同HBV-DNA 載量CHB 病人血清IL

-

1

β

、IL

-

18 水平比較

與HBV-DNA 低載量組比較，中、高載量組CHB 病人血清IL-1β、IL-18 水平依次增加，與HBV-DNA 中載量組比較，高載量組CHB 病人血清IL-1β、IL-18 水平均增加，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表3。

表3 不同HBV-DNA載量CHB病人血清IL-1β、IL-18水平比較/（ng/L，x ± s）

2.4 PBMC 中Mir

-

155、NLRP3 mRNA 水 平 與CHB 病人肝炎炎癥分級及肝纖維化分期的關系

隨肝炎炎癥分級增加、肝纖維化分期增加，PBMC 中Mir-155、NLRP3 mRNA 水平依次增加，差異有統計學意義（均P ＜0.05），見表4。

2.5 CHB 病人PBMC 中Mir

-

155、NLRP3 蛋白水平的相關性分析

Pearson 相關性分析結果顯示，CHB 病人PBMC 中Mir-155、NLRP3 水平呈顯著正相關（r=0.714，P ＜0.05）。見圖2。

圖2 CHB病人外周靜脈血單個核細胞（PBMC）中Mir-155、NLRP3水平的相關性

2.6 CHB病人PBMC中Mir-155、NLRP3水平與血清IL-1

β

、IL-18水平相關性分析

Pearson相關性分析結果顯示，CHB 病人PBMC 中Mir-155 與血清IL-1β、IL-18水平均呈正相關（P ＜0.05），NLRP3水平與血清IL-1β、IL-18水平呈顯著正相關（P ＜0.05）。見表5。

表5 CHB病人外周靜脈血單個核細胞（PBMC）中Mir-155、NLRP3水平與血清IL-1β、IL-18水平相關性

3 討論

CHB 是一種重大肝臟傳染性疾病，全球約20多億HBV 攜帶者，3.6 億CHB 病人，且每年約有60 萬人因HBV 相關性肝衰竭、肝硬化或肝細胞癌死亡，嚴重危害人類健康。目前臨床治療CHB 多以干擾素、核酸類等藥物為主，以靶向病毒逆轉錄酶結構域破壞HBV-DNA 合成，但HBV-DNA 感染機及發病制尚不完全清楚，因此尋找HBV-DNA 復制相關的生物分子進行CHB 靶向治療具有重要意義。miRNA，是一類長鏈非編碼小RNA，與先天性和獲得性免疫密切相關，其中Mir-155 在免疫反應及炎癥反應中發揮重要作用。Abdul-Maksoud 等研究發現，Mir-155 與類風濕性關節炎（RA）疾病活動度及炎癥程度有關，血清Mir-155表達水平在RA 病人中顯著高于健康對照組，且與腫瘤壞死因-α（TNF-α）、IL-1β 水平均呈正相關。Fang 等研究報道，與健康對照組比較，HBV 攜帶者及CHB 病人CD4+、CD8+T 細胞中Mir-155 水平依次升高，CHB病人PBMC 中Mir-155水平升高與T細胞活化有關，是HBV 感染免疫激活疾病進展的潛在標志物。吳曉升等研究報道，與健康對照組比較，CHB 病人PBMC 中Mir-155 水平顯著 下 調，與ALT 正 常 的CHB 病 人 比 較，ALT 升 高 的CHB 病 人PBMC 中Mir-155 水平顯著升高，且于HBV-DNA 無相關性。本研究結果發現，與健康對照組比較，CHB 病 人PBMC 中Mir-155 水 平 顯 著 升 高，隨HBV-DNA 載量增加，CHB 病人PBMC 中Mir-155 水平依次升高，且與血清IL-1β、IL-18 水平均呈正相關，而IL-1β、IL-18均為IL-1家族中重要促炎因子，與Fang 等結果一致，提示Mir-155 水平升高可能與CHB 病人HBV-DNA 復制有關，參與CHB 炎癥反應。但與吳曉升等研究結果不一致，可能，因樣本量選擇差異，有待進一步驗證。

表4 外周靜脈血單個核細胞（PBMC）中Mir-155、NLRP3 mRNA水平與CHB病人肝炎炎癥分級及肝纖維化分期的關系/x ± s

炎性小體由多種分子共同構成的高分子質量、多蛋白復合體，在固有免疫中其重要作用，目前已發現NLRP1、NLRP3、黑色素瘤缺失基因2 及ICE 蛋白酶激活因子4 中炎性小體，其中NLRP3 目前研究最多，結構和功能最為明確。研究報道，HBV 表達的HBx蛋白可上調NLRP3炎性小體表達，NLRP3激活后可刺激半胱天冬氨酸氨基酶-1 前提剪切活化為具有酶活性的Caspase-1，進而促進IL-1β、IL-18等促炎因子成熟并釋放至胞外參與機體免疫、炎癥反應。何子凡等研究報道，NLRP3 炎癥小體參與慢性阻塞性肺疾病（慢阻肺）病人炎癥反應，與健康對照組比較，穩定期、急性加重期慢阻肺病人PBMC 中NLRP3 mRNA、IL-1β、IL-18 水平依次增高。張任飛等研究報道，與正常組、單純2 型糖尿病（T2DM）組、單純慢性牙周炎（CP）組比較，T2DM合并CP 組 病 人 血 清NLRP3、Caspase-1 mRNA 及IL-1β 水平顯著升高，且呈正相關，提示NLRP3 及IL-1β 可促進T2DM 合并CP 病人炎癥反應，與疾病嚴重程度有關。本研究結果發現，CHB 病人PMBC中NLRP3 mRNA 及蛋白水平隨HBV-DNA 載量增加而升高，均高于健康對照組，且與Mir-155 及血清IL-1β、IL-18 水平均呈正相關，與何子凡等、張任飛等研究結果一致。而陳洪濤等研究報道，與健康對照組比較，CHB 病人PBMC 中NLRP3、IL-1β、IL-18 mRNA 水平差異無統計學意義，干擾素誘導蛋白16(IFI16)炎癥小體水平顯著升高，且于HBV-DNA 載量呈正相關，與本研究結果不一致，可能因樣本量選擇不同或CHB 病人HBV-DNA 感染過程中存在其他炎性小體共同參與。另本研究發現Mir-155、NLRP3 mRNA 水平與肝炎癥分級及肝纖維分期有關，綜合以上研究結果及本研究結果提示，Mir-155 可 能 協 同NLRP3 與CHB 病 人HBVDNA 復制有關，促進CHB 病人炎癥反應，有待進一步深入探究。