復方丹參滴丸對糖尿病大鼠腎臟轉化生長因子β1/Smads信號通路表達的影響

羅瓊，李琴，石秀禎，郭愛莉，李靜

作者單位：1長江航運總醫院內分泌科，湖北 武漢430010；2華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院中醫科，湖北 武漢430022

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是最常見的代謝性疾病，近年來，隨著人們生活方式的改變和人口老齡化等因素的影響，糖尿病的發病率正在逐漸增加，已成為繼心腦血管疾病、腫瘤之后的第三大危害人類健康的重大疾?。?-2］。糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常見微血管并發癥，也是導致終末期腎病的主要原因之一［3］。DN 的主要病理改變表現為腎臟纖維化［4］，而轉化生長因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）作為促進腎臟纖維化的細胞因子之一，在慢性腎病中起著至關重要的作用，作為主要的治療靶點正在逐漸被臨床所認可［5-6］。已有研究發現：TGF-β1 可通過激活Smads 信號轉導促進腎上皮向間質轉換，從而導致腎纖維化，最終進展為腎功能不全［7］。大量研究發現，TGF-β1/Smads 信號通路與糖尿病腎病發生、發展及腎臟纖維化密切相關［8-9］。

目前臨床上公認的糖尿病腎病的治療方案常常在嚴格控制控制飲食、血糖、血脂、血壓的基礎上，應用血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（Angiotensin Ⅱreceptor antagonist，AngⅡ）、血管緊張素轉換酶抑制劑（Angiotensin Converting Enzyme Inhibitors，ACEI）等藥物加以防治，但這些措施很難完全有效延緩糖尿病腎病向終末期腎病發展［10］。中醫藥在糖尿病的防治上取得了顯著的成效，復方丹參滴丸（compound Danshen dripping pills，DSP）是一種新型中藥制劑，是目前臨床上用于緩解和治療糖尿病腎臟病變、冠心病等的常見藥物之一。已有研究發現［11-14］，復方丹參滴丸對糖尿病患者早期腎病損害具有明顯的保護作用，但其作用機制并不完全清楚。因此，本研究通過觀察DSP 對DM 大鼠腎臟TGF-β1/Smads 信號通路的影響，從而探討DSP 對糖尿病腎臟保護的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取50 只6～8 周齡的健康清潔級、雄性Wistar 大鼠，體質量（200±20）g，購于昆明醫科大學動物實驗中心，室溫（24±2）℃，濕度（45±5）%，自然光照，室內保持安靜。本研究中對于大鼠的處理符合動物倫理學相關標準。

1.1.2 主要試劑 復方丹參滴丸（天士力制藥集團股份有限公司）；鏈脲佐菌素（美國Sigma 公司）；TGF-β1 兔抗大鼠一抗、重組人β 肌動蛋白（β-actin）兔抗大鼠一抗、羊抗兔IgG（北京博奧森生物技術有限公司）；p-Smad2、p-Smad3 的酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（Cell Signaling 公司）；Smad7、腎損傷分子-1（KIM-1）、骨橋蛋白（OPN）的ELISA 試劑盒（武漢華美公司）；RIPA 裂解液（凱基生物）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（凱基生物）；PCR 引物（博士德生物）；逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒（Taka-Ra）。

1.1.3 主要儀器 全自動生化分析儀（北京普朗新技術有限公司）；血糖儀及配套試紙（三諾生物傳感股份有限公司）；ABI 7500 型實時熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）；酶標儀（美國Molecular Devices 公司）、電泳儀（北京百晶生物技術有限公司）；數碼凝膠圖像處理系統（上海天能科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組及造模 大鼠適應性飼養7 d 后，按隨機數字表法將50 只大鼠隨機分為空白對照組（NC組，n=10）、造模組（n=40）。然后造模組大鼠使用腹腔注射1%鏈脲佐菌素（60 mg/kg）進行造模，對照組大鼠腹腔注射等體積的枸櫞酸緩沖液（0.1 mol/L），在72 h 后尾靜脈采血，從而測定血糖濃度≥16.7 mmol/L時為造模成功［15］。

1.2.2 造模后處置 其中大鼠成模37 只，死亡3只，成模率為92.50%。最后從中選取造模成功的30只老鼠采用隨機數字表法分為糖尿病模型組（DM組，n=10）、復方丹參滴丸低劑量組（DSP 低劑量組，n=10）、復方丹參滴丸高劑量組（DSP 高劑量組，n=10）。DSP 低、高劑量組大鼠每天分別給予200、400 mg/kg 的DSP 與生理鹽水混懸液灌胃治療，NC 組及DM 組大鼠給予等量的生理鹽水灌胃，均每日1 次，持續8周。

1.2.3 血糖、血肌酐、尿素氮檢測 實驗結束，血糖儀檢測各組大鼠空腹血糖（fasting blood-glucose，FBG）水平。腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠后靜脈取血，分離血清，使用全自動生化分析儀進行各組大鼠的血肌酐（serum creatinine，Scr）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）的檢測。

1.2.4 熒光定量PCR 法檢測各組大鼠腎臟組織TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7 的mRNA 表達水平 取各組腎臟組織50 mg，先提取總RNA，然后進行反轉錄，最后對反轉錄產物進行擴增。其中反應體 系 是20 μL，反 應 條 件 是stage1：95 ℃，30 s。stage2：95 ℃，5 s；60 ℃，34 s；40 個循環。PCR 擴增的特異性引物序列見表1。

表1 PCR擴增的特異性引物序列

1.2.5 蛋白質印跡法（Western Blot）檢測各組大鼠腎臟組織TGF-β1 的蛋白表達 取各組腎臟組織80 mg，提取總蛋白，測定其濃度，上樣等質量的蛋白。然后電泳、進行轉膜、封閉、孵育TGF-β1 一抗（1∶1 000）4 ℃過夜，用TBST 清洗，37 ℃孵育二抗（1∶10 000）1 h，再次用TBST 清洗，最后用ELC 發光試劑盒顯影。蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.2.6 ELISA 法檢測各組大鼠尿中KIM-1、尿中OPN 以及腎臟組織p-Smad2、p-Smad3、Smad7的濃度表達水平 代謝籠收集各組大鼠尿液，然后采用ELISA 試劑盒檢測各組大鼠尿中KIM-1、OPN 的濃度。取部分新鮮的腎臟組織，使用ELISA 試劑盒檢測各組大鼠腎臟組織中p-Smad2、p-Smad3、Smad7的濃度表達水平。

1.3 統計學方法應用SPSS 19.0 軟件進行統計學分析。觀測資料均為計量數據，采用x ± s 表示，組間比較采用單因素方差分析，組間方差齊用LSD法，方差不齊用Tamhane’s T2（M）檢驗。P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血糖比較與NC組相比，DM組大鼠血糖明顯升高（P ＜0.05）；與DM 組相比，DSP 低、高劑量組大鼠血糖明顯降低（P ＜0.05），且高劑量組較低劑量組有進一步下降的趨勢。見表2。

2.2 各組大鼠腎損傷標志物水平的比較與NC 組相比，DM組大鼠血Scr、血BUN、尿KIM-1、尿OPN濃度明顯升高（P ＜0.05），提示糖尿病引起了大鼠腎臟損傷；與DM組比較，DSP低、高劑量組大鼠血Scr、血BUN、尿KIM-1、尿OPN 濃度明顯降低（P ＜0.05），且高劑量組尿KIM-1、尿OPN 濃度明顯低于低劑量組（P ＜0.05），說明DSP劑量依賴性地改善了糖尿病大鼠的腎臟損傷，對糖尿病大鼠腎臟具有保護作用。見表2。

2.3 各組大鼠腎臟組織TGF-β1 的mRNA 和蛋白表達與NC組相比，DM組大鼠腎臟組織TGF-β1的mRNA與蛋白表達均明顯升高（P ＜0.05）；與DM組相比，DSP低、高劑量組大鼠腎臟組織TGF-β1的mRNA與蛋白均明顯減低（P ＜0.05），且高劑量組明顯低于低劑量組（P ＜0.05），說明DSP劑量依賴性地抑制了糖尿病大鼠的腎臟TGF-β1表達。見表3，圖1。

2.4 各組大鼠腎臟組織Smads 的mRNA 和蛋白表達

2.4.1 各組大鼠腎臟組織Smad2、Smad3、Smad7 的mRNA 表達 與NC 組比較，DM 組大鼠腎臟組織Smad2、Smad3 的mRNA 表達水平明顯升高（P ＜0.05），而Smad7 的mRNA 表達水平明顯降低（P ＜0.05）；與DM 組比較，DSP 低、高劑量組大鼠腎臟組織Smad2、Smad3 的mRNA 表達水平均明顯減低（P ＜0.05），而Smad7 的mRNA 表達水平明顯升高（P ＜0.05）；且DSP 高劑量組Smad2、Smad3的mRNA表達水平低于DSP 低劑量組（P ＜0.05），Smad7 的mRNA 表達水平高于DSP 低劑量組（P ＜0.05）。見表4。

表2 各組大鼠血糖及腎損傷標志物水平的比較/x ± s

表3 各組大鼠腎臟組織TGF-β1的mRNA和蛋白表達/x ± s

圖1 各組大鼠腎臟組織的蛋白表達（n=10）

表4 各組大鼠腎臟組織Smad2、Smad3、Smad7的mRNA表達/x ± s

2.4.2 各組大鼠腎臟組織p-Smad2、p-Smad3、Smad7 的蛋白表達 與NC 組比較，DM 組大鼠腎臟組織p-Smad2、p-Smad3 的蛋白水平明顯升高（P ＜0.05），而Smad7 的蛋白水平明顯降低（P ＜0.05）；與DM 組比較，DSP 低、高劑量組大鼠腎臟組織p-Smad2、p-Smad3 的蛋白表達水平均明顯減低（P ＜0.05），而Smad7 的蛋白表達水平明顯升高（P ＜0.05）；且DSP 高劑量組p-Smad2、p-Smad3 的蛋白表達水平低于DSP 低劑量組（P ＜0.05），Smad7 的蛋白表達水平高于DSP低劑量組（P ＜0.05）。見表5。

表5 各組大鼠腎臟組織p-Smad2、p-Smad3、Smad7的蛋白表達/x ± s

3 討論

糖尿病在中醫學中被稱為“消渴”，而“糖尿病腎病”是消渴病并發癥，發于腎臟，因此呂仁和教授稱其為消渴病腎?。?6］。消渴病腎病的基本病機為“腎虛血瘀”，而活血益氣法是治療此病的主要措施，并特別強調活血法貫穿整個治療過程［17-19］。DSP 是一種新型中藥制劑，以丹參、冰片、三七等中藥為主要成分，具有活血化瘀、行氣止痛等功效，且具有起效迅速、生物利用度高的特點［20］。其中丹參味苦、性微寒，是主要的活血化瘀中藥，古代醫書上有“一味丹參，功同四物（當歸、川芍、白芍、熟地）”之說。冰片辛香而寒涼，善于開竅醒神、清熱止痛。三七味苦而甘、性溫，具有良好的活血化瘀、止血止痛的功效。現代研究發現：DSP 可改善DM 動物模型的胰島功能、降低血糖水平、緩解炎癥反應［21］、改善DM所引起的心臟［22］、腎臟［23］等臟器的損傷，在DM 及其多種并發癥的防治上顯示了較好的療效［24-26］。

DN 是糖尿病的主要微血管并發癥，也是導致終末期腎病的主要原因之一［27］。當血清Scr、BUN及尿KIM-1、OPN 等指標出現異常的時候，可以提示糖尿病可能出現了腎病的并發癥［28-29］。在評價腎功能損傷時，尿KIM-1、尿OPN 比血肌酐、尿素氮等指標更為敏感，因為血肌酐、尿素氮常常在腎功能嚴重下降時才會發生明顯的變化，而尿KIM-1、尿OPN水平常常在腎臟存在輕微病變時就會發生比較明顯的變化，所以可以被用來評價腎臟的早期損傷［30-31］。本研究發現：與NC 組比較，DM 組大鼠尿KIM-1、尿OPN、血肌酐、血尿素氮濃度明顯升高，提示糖尿病大鼠模型出現腎臟的損傷；與DM 組比較，DSP 低、高劑量組大鼠尿KIM-1、尿OPN、血肌酐、血尿素氮濃度明顯降低，且高劑量組大鼠尿KIM-1、OPN 濃度明顯低于低劑量組，提示DSP 劑量依賴性地改善了糖尿病大鼠的腎臟損傷，對糖尿病大鼠腎臟具有保護作用。

TGF-β1是TGF-β家族中的一個核心成員，具有廣泛的生物學效應。已有研究發現：若腎臟中TGFβ1 的表達水平過高，則可以促進成纖維細胞生長、增加細胞外基質含量，從而引起腎臟硬化［32］。TGFβ1/Smads 信號通路作為TGF-β1 介導的重要信號通路，在腎臟纖維化中發揮著不可替代的作用［33-34］。其中，TGF-β1 可與TGF-β1Ⅱ型受體結合，從而激活TGF-β1Ⅰ型受體并將Smad2、Smad3蛋白磷酸化，而磷酸化的Smad2/Smad3 與Smad4 形成活性的轉錄復合物進入細胞核啟動靶基因的轉錄，最終影響一些參與腎臟損傷分子的表達［35-36］。Smad7是TGF-β1信號通路的負反饋調節因子，主要通過與TGF-β1Ⅰ型受體結合抑制TGF-β1 信號轉導［37］。大量研究發現：糖尿病模型大鼠體內TGF-β1 水平呈高表達，而Smads 信號表達異常的狀態［38］。本研究結果顯示：與NC 組相比，DM 組大鼠腎臟TGF-β1 的mRNA 和蛋白表達明顯升高；Smad2、Smad3 的mRNA 表達水平明顯升高，而Smad7的mRNA表達水平明顯降低；p-Smad2、p-Smad3 的濃度明顯升高，而Smad7 的濃度明顯降低。與DM 組相比，DSP 低、高劑量組大鼠腎臟TGF-β1 的mRNA 和蛋白表達明顯降低；Smad2、Smad3 的mRNA 表 達 水 平 明 顯 降 低，p-Smad2、p-Smad3 的濃度明顯降低，且高劑量組明顯低于低劑量組；而Smad7 的mRNA 表達水平明顯升高，Smad7的濃度明顯升高，且高劑組明顯高于低劑量組。提示：DSP 劑量依賴性的抑制了糖尿病大鼠腎臟TGF-β1/Smads信號通路的表達。

綜上所述，DSP 可能通過抑制TGF-β1/Smads 信號通路，從而延緩STZ誘發的DM大鼠腎損害。