富含亮氨酸重復序列的G蛋白偶聯(lián)受體6通過Wnt/β-連環(huán)蛋白通路對結腸癌SW480細胞增殖、侵襲和凋亡的影響

王康，賈軍梅，仇海樂，陳佩瑤，伊佳虹，張沙沙

作者單位：1山西醫(yī)科大學，山西 太原030001；2山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院腫瘤內科，山西 太原030001

在全球癌癥發(fā)病率和死亡率排名中，結腸癌分別排在第三和第四位[1]。全球每年約有100 多萬結腸癌新發(fā)病例，70 萬結腸癌死亡病例[2]。目前臨床上結腸癌的治療主要以手術治療為主，同時輔以放療和化療的綜合治療措施。由于早期結腸癌缺乏特異性特征，大多數患者發(fā)現時已處于中晚期，其五年生存率不到40%。因此尋找新的治療方法和策略以提高結腸癌的治療效果已成為臨床研究的熱點。基因治療為癌癥的治療提供了一個新概念。明確結腸癌發(fā)生發(fā)展的生物學和遺傳學特征可以為基因治療提供新的證據[3]。

G 蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors，GPCR）是具有7 個跨膜域的膜蛋白，它們調節(jié)與多種疾病相關的各種生理過程［4］。富含亮氨酸重復序列的G 蛋白偶聯(lián)受體6（LGR6）與LGR4 和LGR5 具有高度的同源性，它們在激活Wnt 途徑中發(fā)揮作用［5］。有學者發(fā)現LGR6 是一組基底和腔內祖細胞的標志物，這些細胞誘導腔內乳腺腫瘤的發(fā)生［6］。LGR6在胃癌中升高，并與局部腫瘤生長相關［7］。轉錄組學分析結果顯示，LGR6 在20%～50%的結腸癌病例中存在高甲基化［8］，然而其作用機制尚不明了。本研究自2019 年4—8 月通過下調結腸癌SW480 細胞LGR6 的表達，觀察對結腸癌細胞增殖、侵襲和凋亡的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 結腸癌細胞株SW480 購自中國科學院（上海）典型培養(yǎng)庫。

1.1.2 主要試劑及儀器 胎牛血清（批號20151206）及0.25%胰蛋白酶購自武漢普諾賽生命科技有限公司；Lipofectamine 2000 轉染試劑（批號919437）和Trizol 反轉錄試劑盒（批號50175111）均購自武漢科昊佳生物科技有限公司；MTT 和Transwell 小室購自北京優(yōu)尼康生物科技有限公司。LGR6 的小干擾RNA（LGR6 siRNA）序列購自上海吉瑪制藥技術有限公司。LGR6 陰性對照（LGR6 siCtrl）購自中國通用生物系統(tǒng)公司。二氧化碳細胞培養(yǎng)箱購自美國Forma Scientific 公司。4800型PCR儀購自美國Bio-Rad 公司。352 型酶標儀和DR2700分光光度計均購自美國HACH 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將SW480 細胞接種在含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，并在37 ℃和5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。第2天更換新鮮培養(yǎng)基并檢測細胞密度。當細胞密度達到80% ～90%時，將細胞用0.25%胰蛋白酶消化并進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細胞轉染 將處于對數生長期的結腸癌SW480 細胞制成單細胞懸液（密度為：2×105個細胞/毫升），并接種在6 孔板上，每2 天更換一次培養(yǎng)液。當細胞生長密度達到50%～60%時，將其分為實驗組、陰性對照組和空白對照組。嚴格按照Lipofectamine 2000 的說明書要求，實驗組細胞轉染LGR6siRNA，陰性對照組細胞轉染LGR6 siCtrl，空白對照組只轉染試劑。處理后將細胞在5%二氧化碳培養(yǎng)箱中于37 ℃培養(yǎng)72 h［9］。

1.2.3 轉染后細胞內LGR6 mRNA 表達水平 使用TRIzol 試劑（Invitgen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）從細胞中提取總RNA。使用cDNA 合成試劑盒（北京天根）合成cDNA。以根據制造商的方案使用SYBR-Green 進行qPCR 分析，反應系統(tǒng)包含2 μL cDNA，0.5 μL 正向引物（10 NM），0.5 μL 反向引物（10 NM），10 μL SYBR-格林緩沖液和7 μL 蒸餾水。使用ABI7500 進行數據收集。反應條件如下，50°C 2 min，95 °C2 min，95 °C15 s，60 °C 1 min。40 個循環(huán)。熔體曲線分析的條件為95 °C 15 s，60 °C 1 min和95°C 15 min。引物序列如表1所示。采用2-ΔΔCt法計算LGR6 mRNA的相對表達量。

表1 LGR6 mRNA和GAPDH引物序列

1.2.4 轉染后細胞內蛋白表達水平 采用蛋白質印跡法（Western Blot）技術分別檢測實驗組和對照組LGR6 蛋白表達水平：制備培養(yǎng)細胞全細胞提取物，并使用RIPA 裂解緩沖液（上海碧云天生物技術研究所）進行蛋白印跡分析。用12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白（50 μg），并將其轉移到聚偏氟乙烯膜上（美國EMD Milliperate）。用5%脫脂奶粉在室溫下封閉膜1 h。加入一抗在4°C下孵育過夜。用PBS-Tween-20 洗滌3 次，每次10 min，加入山羊抗小鼠或山羊抗兔二抗在室溫下孵育1 h。使用增強的化學發(fā)光Western印跡檢測系統(tǒng)（Invitrogen）和X射線膠片對印跡進行顯影。頻帶密度通過ImageJ 軟件（美國馬里蘭州貝塞斯達的國立衛(wèi)生研究院）進行鑒定。以GAPDH 作為內參，計算LGR6、Bax、Cleaved caspase 3、β-連 環(huán) 蛋 白（βcatenin）和c-Myc蛋白表達水平。

1.2.5 SW480 增殖活性檢測 分別取實驗組和對照組細胞懸液各100 μL（含約2 000 個細胞）置于96 孔培養(yǎng)皿中。每孔加入100 μL MTT 溶液，在細胞培養(yǎng)箱內繼續(xù)孵育4 h。每孔加入100 μL Formanzan 溶解液，在細胞培養(yǎng)箱內再繼續(xù)孵育。直至在普通光學顯微鏡下觀察發(fā)現Formazan 全部溶解。記錄570 nm處吸光度值。

1.2.6 Transwell 小室法檢測結腸癌SW480 細胞侵襲 轉染后72 h，將SW480 細胞用用無菌PBS 洗滌2 次，用無血清RPMI 1640 重懸，調整細胞濃度至1×106個/mL。將含有10%BSA 的RPMI 1640 培養(yǎng)液600 μL 加入24 孔板中，每個Transwell 小室加入200 μL 細胞懸液后放入24 孔板。每組做5 個復孔。常規(guī)培養(yǎng)24 h 后取出Transwell 小室，去除小室上室面細胞。并以95%的酒精固定小室約10 min，再以Giemsa 染液染色10 min PBS 沖洗后常溫干燥。光鏡下拍照，每個Transwell小室隨機選10個視野光鏡下拍照，取平均值進行統(tǒng)計。

1.2.7細胞凋亡實驗 轉染后72 h，將SW480 細胞用0. 25%胰蛋白酶（不含EDTA）消化收集，用PBS洗滌2 次，懸浮于500 μL Binding Buffer 緩沖液中，然后與5 μL Annexin V-FITC 混合，最后再加入5 μL PI 混勻，并在室溫下反應10 min。采用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件分析，所有實驗數據結果均以x ± s表示，多組均數的比較采用單因素方差分析，其中兩兩比較采用LSD-t 法，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SW480 細胞轉染LGR6 基因結果比較qPCR分析顯示，實驗組、陰性對照組和空白對照組LGR6 mRNA 表達水平分別為（0.42±0.08）、（1.12±0.08）、（1.13±0.31），實驗組LGR6 mRNA 表達水平顯著降低（P ＜0.05）。Western-Blot 結果顯示，實驗組LGR6蛋白表達顯著高于陰性對照組和空白對照組（P ＜0.05）；陰性對照組和空白對照組LGR6 蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見圖1。

圖1 SW480細胞轉染LGR6基因結果及Western-Blot結果比較：A為基因結果；B為Western-Blot結果

2.2 SW480 細胞增殖活性比較細胞活性檢測結果顯示，轉染后24、48、72 h 時實驗組細胞增殖活性（0.24±0.04）、（0.27±0.06）、（0.45±0.08）、（0.63±0.09）顯著低于陰性對照組（0.22±0.03）、（0.40±0.05）、（0.92±0.07）、（1.32±0.11）和 空 白 對 照 組（0.26±0.04）、（0.42±0.07）、（0.94±0.09）、（1.21±0.12），均P ＜0.05，空白對照組和陰性對照組細胞增殖活性差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見圖2。

圖2 結腸癌SW480細胞增殖活性

2.3 SW480 細胞侵襲能力比較Transwell 實驗表明：實驗組結腸癌SW480細胞侵襲細胞數為（42.38±6.12）×103個，陰性對照組組（94.21±16.54）×103個；空白對照組（97.76±18.24）×103個。實驗組侵襲細胞數顯著低于陰性對照組和空白對照組（P ＜0.05）。陰性對照組和空白對照組侵襲細胞數差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見圖3。

圖3 結腸癌SW480細胞侵襲能力比較：A為兩組Transwell圖；B為兩組侵襲細胞數比較

2.4 SW480 細胞凋亡水平比較細胞凋亡實驗顯示，實驗組、陰性對照組和空白對照組細胞凋亡率（%）分別為（8.04±1.76）、（1.91±0.42）、（1.88±0.31），實驗組結腸癌SW480 細胞凋亡率顯著高于陰性對照組和空白對照組（P ＜0. 05）；空白對照組和陰性對照差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見圖4。

圖4 結腸癌SW480細胞凋亡水平比較

2.5 SW480細胞Wnt/βcatenin相關蛋白表達水平比較轉染后48 h，實驗組Bax和Cleaved caspase 3蛋白表達顯著高于陰性對照組和空白對照組和（P ＜0.05）；β catenin和c-Myc蛋白表達顯著低于陰性對照組和空白對照組（P ＜0.05）。陰性對照組和空白對照組Bax、Cleaved caspase 3、β catenin和c-Myc蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見圖5。

圖5 細胞內LGR6蛋白表達水平

3 討論

結腸癌是一種惡性腫瘤，屬于高致死性腫瘤之一［10］。隨著中國經濟的快速發(fā)展，結腸癌在中國的發(fā)生率也呈現逐年增加趨勢，如今已成為中國高發(fā)的腫瘤之一，尤其在廣東和上海等城市［11］。結腸癌的形成是一個逐漸發(fā)展的過程，是由多因素導致的綜合性腫瘤，包括內源性因素和外部刺激等。環(huán)境因素諸如抽煙，喝酒均可能引起關鍵信號通路（如MAPK 信號通路和Wnt 信號通路等）的變化，進而引起結腸癌的發(fā)生。先前研究發(fā)現LGR6 在多種腫瘤中上調，如基底細胞樣皮膚癌［12］和胃癌［13］。Ruan等［14］研究發(fā)現，沉默LGR6 的表達可通過抑制Wnt/β-Catenin 信號通路降低卵巢癌細胞的化療耐藥性。Wang 等［15］發(fā)現LGR6 的表達可作為結腸腺癌患者獨立的預后指標。本研究實驗組LGR6 蛋白表達顯著高于陰性對照組和空白對照組。陰性對照組和空白對照組LGR6 蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義，證明LGR6 siRNA 轉染成功。轉染后實驗組細胞OD 值和侵襲細胞數均顯著低于陰性對照組和空白對照組（P ＜0.05），細胞凋亡率顯著高于陰性對照組和空白對照組，說明下調LGR6 可抑制結腸癌SW480 細胞增殖和侵襲，并促進細胞凋亡。與先前的研究一致。

Wang 等［16］研究發(fā)現LGR6 通過PI3K/AKT 通路促進HCT-116 和SW480結腸癌細胞的增殖和侵襲。Wnt/β catenin信號通路在調節(jié)多種類型腫瘤細胞增殖過程中發(fā)揮重要的作用，近90%結腸癌的發(fā)生都與此信號通路的激活有關［17］。有學者發(fā)現，激活Wnt/β catenin信號通路可導致β-catenin轉運至細胞核，并激活下游靶基因如c-Myc、cyclin D1 等，從而參與結腸癌的發(fā)生和發(fā)展［18］。也有研究發(fā)現，Wnt/β catenin信號通路的抑制可抑制結腸癌細胞增殖并誘導凋亡［19］。尚無研究探討LGR6 對結腸癌細胞Wnt/β catenin 信號通路的影響。本研究以Wnt/β catenin 信號通路為切入點，從另一方面探討了LGR6 影響結腸癌發(fā)生發(fā)展的可能機制。結果發(fā)現，實驗組細胞中促進凋亡誘導分子Bax 和Cleaved caspase 3蛋白表達顯著高于陰性對照組和空白對照組，且Wnt 信號通路的關鍵分子β catenin 和下游靶基因c-Myc 的蛋白表達顯著低于陰性對照組和空白對照組，說明下調LGR6 可能通過調節(jié)Wnt/βcatenin 信號通路而抑制結腸癌SW480 細胞增殖和侵襲，誘導細胞凋亡。

綜上所述，LGR6 低表達可抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活，從而抑制結腸癌SW480 細胞的增殖和侵襲并促進細胞凋亡，抑制結腸癌的發(fā)生和發(fā)展。然而，尚需深入和系統(tǒng)的基礎研究了解其具體機制與結腸癌腫瘤微環(huán)境之間的關系。