硫酸右旋糖苷通過影響M2型腫瘤相關巨噬細胞抑制人胃癌細胞侵襲與遷移的作用機制

尚靜，焦龍杏，李夢琪，郭嘉欣，楊旭，常瑞，徐遠義，黃允寧*

1寧夏醫科大學附屬自治區人民醫院/西北民族大學第一附屬醫院胃腸外科，銀川 750001；2寧夏醫科大學基礎醫學院病理學系，銀川 750004

胃癌患者多數死于腹腔種植轉移[1]。腹腔種植轉移與腫瘤微環境密切相關，腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages，TAMs)是腫瘤微環境的重要組成部分[2-3]。程序性死亡配體1(programmed death ligand 1，PD-L1)是腫瘤常見分子標志物，存在于癌細胞表面并與細胞毒T細胞表面的免疫檢查點程序性死亡受體1(programmed death receptor 1，PD-1)結合，從而使活性T細胞失活，逃避免疫識別[4]，與不良預后相關。研究M2型腫瘤相關巨噬細胞(M2 tumor-associated macrophages，M2-TAMs)對胃癌細胞惡性生物學行為的影響，對于尋找新的胃癌治療靶點具有十分重要的意義。硫酸右旋糖苷(dextran sulfate，DS)是一種大分子糖類，具有來源廣、腹腔作用時間長、毒副作用小的特點。研究表明，DS對人胃癌細胞具有直接抑制作用，表現在可抑制人胃癌細胞黏附、血管生成，并促進其凋亡、侵襲遷移和上皮-間質轉化等多個方面[5]。 有報道稱PD-L1在癌細胞中的表達與TAMs的數量有關[6]。DS除了上述直接作用外是否可通過巨噬細胞間接抑制人胃癌細胞的侵襲和遷移有待進一步研究。本研究旨在探討DS通過影響M2-TAMs抑制人胃癌細胞HGC-27侵襲和遷移的作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人胃未分化腺癌細胞株HGC-27由哈爾濱醫科大學贈與，THP-1人單核細胞株購自上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.1.2 藥品 DS購自美國Sigma-Aldich公司(貨號D8906)。

1.1.3 試劑 RPMI 1640培養基購自美國HyClone公司；佛波酯-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)購自美國Sigma-Aldich公司；IL-4和IL-13購自美國Peprotech公司；兔單克隆抗體CD163、小鼠單克隆抗體PD-L1購自英國Abcam公司。

1.1.4 裸鼠 雄性BALB/c裸鼠24只，4～6周齡，體重18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[生產許可證號：SCXX(京)2006-009]。

1.1.5 人胃癌組織標本 收集寧夏回族自治區人民醫院2018年2月－2019年10月經手術切除、術后病理確診為胃腺癌的組織標本46例，所有患者術前均未接受放化療。

1.2 方法

1.2.1 M2的誘導與驗證 取對數生長期THP-1細胞接種于10 mm培養皿內，經PMA誘導培養48 h后，加入IL-4、IL-13為M2組，加入IL-4、IL-13以及DS為DS組，干預36 h后觀察細胞形態變化，利用免疫熒光和Western blotting檢測細胞表面標志物CD163的表達。

1.2.2 細胞培養與藥品處理 將THP-1、胃癌HGC-27細胞置于含10%FBS的RPMI 1640培養基中，于37 ℃、5%CO2培養箱內培養，當細胞匯合度達80%時，取對數生長期THP-1細胞，調整細胞密度為2×105個/ml，種板，進行下述實驗。稱取適量DS溶解于PBS中，混勻后經22 μm過濾器滅菌，使用前用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基稀釋至終濃度為0.3%。

1.2.3 構建裸鼠胃癌腹腔種植轉移模型 BALB/c 裸鼠24只，隨機分為對照組與DS組，每組12只。將人胃癌HGC-27細胞懸液密度調整為5×107個/ml (0.2 ml/只)，兩組均腹腔注射。24 h后對照組裸鼠腹腔注射生理鹽水(1 ml/只)，DS組裸鼠腹腔注射0.3%的DS(1 ml/只)，14 d后處死。

1.2.4 免疫組化染色 將裸鼠大網膜及瘤組織浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定，脫水、包埋、切片、抗原修復后依次加入一抗及二抗孵育并顯色。倒置顯微鏡下觀察并采集圖像。結果判定標準：棕黃色顆粒顯像為PD-L1、CD163表達陽性。

1.2.5 免疫組織熒光雙染 人胃癌組織病理切片經脫蠟水化、抗原修復、封閉處理后，孵育不同種屬來源的一抗4 ℃過夜，熒光二抗孵育后，加DAPI，封片。在400倍鏡下隨機選取5個視野，采集圖像。PD-L1和CD163主要分布于胞膜和胞質，PD-L1蛋白用紅色熒光標記，CD163蛋白用綠色熒光標記，DAPI發藍色熒光用來標記細胞核。應用Image-Pro Plus軟件測定光密度(OD)值，各組均取5張圖的平均OD值，應用Adobe Photoshop CS5軟件合并圖片。

1.2.6 免疫細胞熒光染色 誘導THP-1細胞使其成為貼壁的巨噬細胞爬片。經4%多聚甲醛固定15 min，0.2%TritonX-100通透20 min，10%山羊血清封閉30 min，一抗反應4 ℃過夜，二抗反應37 ℃ 1 h，滴加DAPI工作液，封片。CD163用FITC標記，細胞核用DAPI標記。應用Image-Pro Plus圖像分析軟件，在400倍鏡下隨機選取5個視野，獲得所選視野的平均光密度值。

1.2.7 Western blotting檢測蛋白表達 裂解蛋白，EP管置冰上5 min后，振蕩30 s，重復5次，吸取上清。BCA法測蛋白濃度，100 ℃煮蛋白10 min。配膠、上樣，進行SDS-PAGE膠電泳，切膠、轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、曝光。應用Image-Pro Plus圖像分析軟件測量各條帶的灰度值，以β-tubulin為內參，用各組目的蛋白與內參蛋白表達灰度值的比值來表示相對蛋白量。

1.2.8 劃痕實驗 共培養體系建立：將對數生長期的HGC-27細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁生長90%～100%，用200 μl槍頭比著直尺畫橫線，PBS沖洗3次，拍照。取對數生長期M2，添加含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基重懸后調整細胞密度為5×105個/ml，將細胞分為4組：(1)對照組，僅培養HGC-27；(2)DS組，0.3%DS干預的HGC-27細胞；(3)M2組，將M2接種在Transwell小室上室內，HGC-27細胞接種在下室；(4)DS+M2組，將M2接種在Transwell小室上室內，0.3%DS干預的HGC-27細胞接種在下室；下室用無血清培養液繼續培養。重復3孔，培養24、48 h，顯微鏡下觀察，拍照。

1.2.9 Transwell侵襲實驗 稀釋基質膠鋪于小室上室。待基質膠凝固后，收集對數生長期HGC-2 7 細胞，用不含FBS的培養基調整細胞密度為5×104/孔接種于小室上室。下室分別為：(1)對照組，10%FBS完全培養基；(2)DS組，加入0.3%DS的10%FBS完全培養基；(3)M2組，用10%FBS完全培養基培養的M2；(4)DS+M2組，加入0.3%DS的10%FBS完全培養基培養的M2。重復3孔，培養箱中培養24 h，輕柔擦棄上室細胞與基質膠，經4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌，0.1%結晶紫染色15 min，顯微鏡下觀察。隨機選取5個200倍視野拍照，計算各組中穿膜細胞數量。

1.3 統計學處理 采用SPSS 20.0 統計學軟件進行數據分析。計量資料以±s表示，若符合正態性和方差齊性，則兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD法。對于3個時間點的重復測量數據，采用重復測量資料的方差分析，因子間相關性分析采用Pearson法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 體外實驗

2.1.1 經誘導分化的THP-1細胞形態改變 經PMA誘導48 h后，THP-1細胞由懸浮狀態變成貼壁狀態，具備M0形態；IL-4、IL-13繼續誘導M0 36 h后定向分化為M2，細胞伸出偽足，呈長梭形、多邊形，形態多樣，但在M0階段加入DS或在IL-4、IL-13干預同時加入DS 36 h后M2形態的細胞數量相對減少(圖1)。

2.1.2 THP-1的誘導分化鑒定 結果顯示，M2特異性表型標志物CD163表達處發綠色熒光，主要分布于細胞質和細胞膜。與M0相比，M2特異性表型CD163表達升高，為M2型巨噬細胞誘導分化成功狀態(圖2)。

2.1.3 DS對M0誘導分化的影響 結果顯示，與M0組相比，DS組和M2組CD163表達增高(0.35±0.11 vs. 1.29±0.06，P＜0.01；0.35±0.11 vs. 1.56±0.11，P＜0.01)；與DS組相比，M2組CD163表達增高 (P＜0.05，圖3)。

2.1.4 各組人胃癌HGC-27細胞的侵襲能力 對照組的穿膜細胞數高于DS組(544.67±55.50 vs. 178.33±19.30，P<0.01)；M2組的穿膜細胞數高于對照組(912.00±41.07 vs. 544.67±55.50，P<0.01)；DS+M2組穿膜細胞數低于M2組(254.33±33.53 vs. 912.00±41.07，P<0.01)，DS組穿膜細胞數低于DS+M2組(178.33±19.30 vs. 254.33±33.53，P<0.05，圖4)。

圖1 THP-1細胞經誘導分化的形態變化Fig.1 Morphological changes of induced differentiation of THP-1 cells

圖2 細胞免疫熒光檢測CD163的表達(×40)Fig.2 CD163 expression detected by cellular immunofluorescence (×40)

圖3 Western blotting檢測各組CD163的表達情況Fig.3 CD163 expression in each group (Western blotting)

2.1.5 各組人胃癌HGC-27細胞的遷移能力 重復測量資料的方差分析結果顯示，多組間比較差異存在統計學意義(F=738.72，P＜0.05)，表明組間遷移距離存在差異。進一步兩兩比較發現，24 h對照組遷移距離大于DS組[(183.04±2.50) μm vs. (94.78±4.69) μm，P＜0.01]；M2組遷移距離大于對照組[(194.74±6.43) μm vs. (183.04±2.50) μm，P＜0.05]；DS+M2組遷移距離小于M2組[(110.86±7.56) μm vs. (194.74±6.43) μm，P＜0.01]；DS+M2組遷移距離大于DS組[(110.86±7.56) μm vs. (94.78±4.69) μm，P ＜0.0 1]。在4 8 h 對照組遷移距離大于D S 組[(278.77±11.66) μm vs. (167.62±6.79) μm，P＜0.01]；M2組遷移距離大于對照組[(436.13±3.89) μm vs. (278.77±11.66) μm，P＜0.01]；DS+M2組遷移距離小于M 2 組[(3 1 1.2 8 5±2.7 7) μ m v s. (436.13±3.89) μm，P＜0.01]；DS+M2組遷移距離大于DS組[(311.285±2.77) μm vs. (167.62±6.79) μm， P＜0.01](圖5)。

圖4 Transwell侵襲實驗檢測各組人胃癌HGC-27細胞的侵襲能力Fig.4 Detection of invasive ability of human gastric cancer HGC-27 cells in each group (Transwell invasion assay)

圖5 劃痕實驗檢測各組人胃癌HGC-27細胞遷移能力Fig.5 Detection of migration ability of human gastric cancer HGC-27 cells in 24 h and 48 h groups (wound healing test)

2.2 動物實驗

2.2.1 DS對胃癌腹腔種植轉移的影響 胃癌細胞腹腔種植轉移瘤顏色灰白，質地硬。與對照組相比，DS組的胃癌細胞腹腔種植轉移瘤結節數量明顯減少，體積明顯縮小(圖6)。

2.2.2 DS對大網膜瘤組織中CD163表達的影響 結果顯示，CD163陽性表達定位于細胞質、細胞膜，呈棕黃色，DS組CD163陽性細胞OD值低于對照組(0.37±0.20 vs. 1.37±0.30，P<0.01，圖7)。

2.3 人胃癌組織

2.3.1 免疫組化檢測不同分化程度胃癌CD163的表達 低分化腺癌(PD)的CD163表達與高分化腺癌(WD)和癌旁組織(PT)相比均增高(P<0.05)；與癌旁組織(PT)相比，高分化腺癌(WD)的CD163表達無顯著增高，差異無統計學意義(P＞0.05，圖8)。

圖6 DS對胃癌腹腔種植轉移的影響Fig.6 Effect of DS on intraperitoneal implantation of metastatic tumor of gastric cancer

2.3.2 免疫組織熒光染色檢測PD-L1與CD163的表達及相關性 結果顯示，PD-L1表達處發紅色熒光，主要分布于細胞膜，CD163表達處發綠色熒光，主要分布于細胞膜和細胞質。與PD-L1(+)組比較，PD-L1(-)組熒光強度明顯減弱(P<0.05)。將圖片合并后可見紅光位于腫瘤實質、綠光位于腫瘤間質，且CD163表達越強，PD-L1陽性表達越強，CD163與PD-L1的表達呈正相關(r=0.40，P<0.05，圖9)。

3 討 論

癌細胞轉移和復發是胃癌患者死亡的主要原 因[6]。術后化療可清除微轉移灶及殘余腫瘤，是治療胃癌術后轉移的有效方法。大多數靜脈化療藥物不能到達腹腔，導致其功效降低，而直接注射入腹腔的藥物更容易達到有效濃度，DS正是這種具有腹腔注射應用潛力的藥物之一。

圖7 免疫組化檢測DS對大網膜瘤組織中CD163表達的影響Fig.7 Effect of DS on CD163 expression in greater omentum tumor (immunohistochemistry)

圖8 免疫組化檢測不同分化程度胃癌CD163的表達(×20)Fig.8 Immunohistochemical detection of CD163 expression in different differentiated gastric cancer (×20)

圖9 免疫組織熒光染色檢測PD-L1與CD163的表達(×20)Fig.9 Expression of PD-L1 and CD163 detected by immunofluorescence staining

腫瘤的進展伴隨著微環境的改變，如腫瘤細胞、間質細胞和免疫細胞分泌的趨化因子、細胞因子和其他因子[8-9]，以及局部缺氧、炎癥和高水平乳酸的存在，可使血液中的單核細胞系列被招募到腫瘤微環境中成為TAMs[10]，發育成具有不同免疫防御和免疫監視功能的兩大類，即經典激活的巨噬細胞(M1)和交替激活的巨噬細胞(M2)，M1具有促炎和抗腫瘤、防止腫瘤免疫逃逸的作用，M2具有抗炎和促腫瘤、幫助腫瘤免疫逃逸的作用[11]。

本研究中，M2組CD163的表達高于DS組，與形態學觀察結果一致，表明DS能夠抑制M0向M2方向的極化，其機制可能是DS作用于激活M2極化的細胞因子IL-6、IL-10、TGF-β和單核細胞集落刺激因子[12]或者其他影響M2極化的信號通路。侵襲和遷移實驗的結果表明，DS對HGC-27細胞的侵襲、遷移有抑制作用，M2對HGC-27細胞的侵襲、遷移有促進作用，DS可以抑制M2促HGC-27細胞的侵襲、遷移作用。因此，可以將DS干預M0并抑制其向M2分化的相關機制作為下一步研究的主要 內容。

體內實驗表明，裸鼠腹腔內種植的腫瘤結節數量及體積隨癌細胞注射時間的延長而明顯增多、增大。與對照組相比，DS可以抑制人胃癌細胞增殖及腹腔種植轉移。免疫組化結果顯示，DS可以抑制M2-TAMs特異性表型標志物CD163的表達，表明DS可以減少M2-TAMs的數量。因此，DS可能通過影響M2-TAMs這一間接作用抑制人胃癌細胞HGC-27 的增殖、侵襲和遷移。

癌細胞可以通過上調免疫檢查點蛋白如PD-L1來逃避免疫監視，這種逃逸可以通過使用免疫檢查點阻斷劑(ICB)來抵消，如帕普利珠單抗和納武單抗，它們可以中斷PD-1與PD-L1之間的相互作用[13]。 免疫組化和免疫熒光檢測結果表明，M2-TAMs的浸潤程度可能與臨床病理特征有關，病理惡性程度越高，胃癌微環境中M2-TAMs細胞數量越多。PD-L1陽性的胃癌標本中CD163陽性細胞密度明顯高于PD-L1陰性的胃癌標本，證實了PD-L1陽性的人胃癌細胞周圍有明顯的M2浸潤，PD-L1表達與CD163陽性的巨噬細胞浸潤相關，提示M2-TAMs可能促進了人胃癌細胞PD-L1的表達。這些結果也提示M2-TAMs浸潤可作為PD-L1表達的預測標志物，M2-TAMs可作為潛在的治療靶點。據報道，在肝細胞癌、胰腺癌和胃癌中，腫瘤細胞PD-L1的表達與TAM的數量有關[6,14]。Kasikara等[15]發現TAMs受體(Tyro3、Axl、Mertk)上調了乳腺癌細胞系中PD-L1的表達，支持了M2-TAMs可能激活腫瘤細胞中PD-L1表達的觀點。M2-TAMs激活腫瘤細胞中PD-L1表達的機制還需要進一步的研究，本課題組目前正在對這一機制進行評估。

綜上所述，DS可抑制M2促HGC-27細胞的侵襲和遷移作用，并下調CD163的表達，其作用機制可能是通過抑制M0向M2方向的極化，降低M2促腫瘤作用，從而影響腫瘤的生長。本研究為DS抑制裸鼠腹腔種植轉移的作用機制提供了理論支持，并為開發預防和治療胃癌腹腔轉移的有效藥物提供了新的依據。