miR-1285對卵巢癌OVCAR3細胞侵襲遷移的影響及其機制

李娜，尤娟娟，權麗麗

1遵義醫科大學附屬醫院婦科，貴州遵義 563003；2三門峽市中心醫院婦科，河南三門峽 472000

卵巢癌是女性常見的生殖系統惡性腫瘤之一，發病率和病死率均較高，嚴重危害女性的健康。卵巢癌的早期癥狀隱匿，尚無特異性診斷指標[1]，多數患者確診時已發展至晚期并伴隨腫瘤轉移，給臨床治療造成了一定困難[2]。卵巢癌的主要特征是腫瘤細胞快速生長及向遠處轉移，腫瘤細胞廣泛浸潤及轉移是造成患者死亡的主要原因[3]。微小RNA(miRNA，miR)是一類不具備編碼蛋白質能力的小分子RNA，但可在轉錄水平參與多個基因的調控，發揮癌基因或抑癌基因的作用，與腫瘤細胞的增殖、轉移及侵襲過程密切相關[4]。卵巢癌患者體內多個miRNA表達失調，可能參與了卵巢癌的發生發展過程。miR-1285是一種高度保守的miRNA，在多種腫瘤細胞中異常表達，主要通過調節下游基因以及抑制腫瘤細胞增殖、侵襲及遷移等而發揮抑癌作用[5]。但目前關于miR-1285在卵巢癌中的作用研究尚少，本研究對人卵巢癌OVCAR3細胞轉染miR-1285，過表達后觀察細胞侵襲及遷移能力，探討miR-1285對細胞的影響及可能機制，以期為臨床治療卵巢癌提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 人卵巢癌OVCAR3細胞購自中國科學院上海細胞庫。LipofectamineTM2000試劑盒(美國Invitrogen公司)，含miR-1285擬似物(miR-1285-mimics)、無義隨機序列(miR-1285-NC)、過表達Yes相關蛋白1(yes-associated protein 1，YAP1)的pcDNA3.1重組質粒(上海吉瑪制藥技術有限公司)，Transwell細胞培養小室(美國Corning公司)，兔抗人YAP1單抗、E鈣黏蛋白(E-cadherin)多抗、波形蛋白單抗(美國Cell Signaling Technology公司)，HRP標記的山羊抗兔二抗(美國Abcam公司)，DYY-6C電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將OVCAR3細胞置于含10%胎牛血清+100 U/ml青霉素+100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養基中，于5%CO2、37 ℃條件下常規培養。2～3 d傳代一次，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2 細胞轉染及分組 將OVCAR3細胞隨機分為miR-1285-mimics組、miR-1285-NC組、miR-1285-mimics+YAP1組、對照組。轉染前1 d，調整細胞密度為1×106個/ml，接種于6孔板，待細胞融合達80%時進行轉染。按照LipofectamineTM2000說明書步驟，miR-1285-mimics組、miR-1285-NC組和miR-1285-mimics+YAP1組細胞分別轉染含有miR-1285-mimics、miR-1285-NC和miR-1285-mimics+YAP1序列的質粒脂質體復合物，對照組僅加入LipofectamineTM2000。轉染48 h后置于熒光顯微鏡下觀察轉染效率。

1.2.3 qRT-PCR法檢測細胞中miR-1285的相對表達水平 取穩定轉染的各組細胞，Trizol法提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA。配制反應體系：包括正反向引物各0.5 μl，cDNA模板2 μl，PCR Master Mix 10 μl，加雙蒸水至總體積20 μl。擴增條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性20 s、55 ℃退火30 s、70 ℃延伸30 s，共進行35個循環。以U6為內參照，采用2-ΔΔCt法計算miR-1285的相對表達水平，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.4 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 取穩定轉染的各組細胞，調整細胞密度為1×106個/ml，接種于6孔板，待各組細胞鋪滿板底時棄去培養基，用滅菌移液槍頭在孔中間垂直劃一條豎線，PBS洗去劃下的細胞，顯微鏡下拍照，記錄初始劃痕距離，繼續培養24 h后，觀察各組細胞的愈合狀態。劃痕愈合率(%)=(初始劃痕距離－24 h劃痕距離)/初始劃痕距離×100%。

1.2.5 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 用不含血清的DMEM培養基按1:2比例稀釋Matrigel膠，放入培養箱中，于37 ℃靜置30 min取出，將Matrigel膠鋪在Transwell小室上室，重懸細胞為5×105個/ml，取100 μl細胞懸液接種于上室，下室加入600 μl含10%胎牛血清的DMEM培養基，常規培養24 h，4%甲醛固定10 min，0.1%結晶紫染色5 min，顯微鏡下任意選取5個視野，記錄穿膜細胞數，取平均值。

1.2.6 Western blotting法檢測細胞中YAP1、E-cadherin、波形蛋白的相對表達水平 取穩定轉染的各組細胞，加入RIPA裂解液，提取各組細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入YAP1、E-cadherin、波形蛋白一抗(1:2000)4 ℃孵育過夜，T B ST 洗膜，加入H R P 標記的二抗(1:5000)室溫孵育1 h，TBST洗膜，采用ECL放射自顯影，Image J軟件分析圖像，以β-actin為內參，以目的蛋白條帶灰度值與內參條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達水平。

1.3 統計學處理 采用SPSS 25.0軟件進行分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組細胞轉染效率比較 熒光顯微鏡下，miR-1285-mimics組、miR-1285-NC組及miR-1285-mimics+YAP1組的細胞均有熒光蛋白表達，轉染效率>85%，可用于后續實驗(圖1)。

圖1 各組卵巢癌OVCAR3細胞轉染效率(熒光顯微鏡 ×200)Fig.1 Transfection efficiency of ovarian cancer OVCAR3 cells in each group (Fluorescence microscope ×200)

2.2 各組細胞中miR-1285相對表達水平比較 對照組、miR-1285-NC組、miR-1285-mimics組、miR-1285-mimics+YAP1組miR-1285相對表達水平分別為0.26±0.06、0.28±0.07、1.36±0.11、1.31±0.10，差異有統計學意義(F=247.424，P<0.001)；與對照組、miR-1285-NC組比較，miR-1285-mimics組、miR-1285-mimics+YAP1組miR-1285相對表達水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.001)；對照組與miR-1285-NC組、miR-1285-mimics組與miR-1285-mimics+YAP1組miR-1285相對表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3 各組細胞遷移能力比較 對照組、m i R-1285-NC組、miR-1285-mimics組、miR-1285-mimics+YAP1組劃痕愈合率分別為(83.26±8.45)%、(82.94±8.33)%、(42.58±6.17)%、(62.36±7.15)%，差異有統計學意義(F=32.868，P<0.001)。與對照組、miR-1285-NC組比較，miR-1285-mimics組、miR-1285-mimics+YAP1組劃痕愈合率降低，差異有統計學意義(P<0.001)；miR-1285-mimics+YAP1組劃痕愈合率高于miR-1285-mimics組(P<0.001)。對照組與miR-1285-NC組劃痕愈合率比較差異無統計學意義(P>0.05，圖2)。

圖2 各組卵巢癌OVCAR3細胞遷移能力比較(劃痕實驗 ×100)Fig.2 Comparison of cell migration ability of ovarian cancer OVCAR3 cells in each group (Scratch test ×100)

2.4 各組細胞侵襲能力比較 對照組、m i R-1285-NC組、miR-1285-mimics組、miR-1285-mimics+YAP1組穿膜細胞數分別為(286.59±27.36)個、(276.28±26.74)個、(87.42±15.63)個、(162.54±18.49)個，差異有統計學意義(F=180.470，P<0.05)。與對照組、miR-1285-NC組比較，miR-1285-mimics組、miR-1285-mimics+YAP1組穿膜細胞數明顯減少(P<0.001)；miR-1285-mimics+YAP1組穿膜細胞數明顯多于miR-1285-mimics組(P<0.001)。對照組與miR-1285-NC組穿膜細胞數比較差異無統計學意義(P>0.05，圖3)。

圖3 各組卵巢癌OVCAR3細胞侵襲能力比較(Transwell)Fig.3 Comparison of invasion ability of ovarian cancer OVCAR3 cells in each group (Transwell)

2.5 各組細胞中YAP1、E-cadherin、波形蛋白相對表達水平比較 Western blotting檢測結果顯示，4組細胞中YAP1、E-cadherin、波形蛋白相對表達水平差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組、miR-1285-NC組比較，miR-1285-mimics組、miR-1285-mimics+YAP1組YAP1、波形蛋白相對表達水平降低，E-cadherin蛋白相對表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)；miR-1285-mimics+YAP1組YAP1、波形蛋白相對表達水平高于miR-1285-mimics組，E-cadherin蛋白相對表達水平低于miR-1285-mimics組，差異有統計學意義(P<0.05)。對照組與miR-1285-NC組的YAP1、E-cadherin、波形蛋白相對表達水平比較差異均無統計學意義(P>0.05，表2，圖4)。

表2 各組卵巢癌OVCAR3細胞中YAP1、E-cadherin、波形蛋白相對表達水平比較(±s，n=5)Tab.2 Comparison of relative expression levels of YAP1, E-cadherin and Vimentin protein in each group of ovarian cancer OVCAR3 cells (±s, n=5)

表2 各組卵巢癌OVCAR3細胞中YAP1、E-cadherin、波形蛋白相對表達水平比較(±s，n=5)Tab.2 Comparison of relative expression levels of YAP1, E-cadherin and Vimentin protein in each group of ovarian cancer OVCAR3 cells (±s, n=5)

與對照組比較，(1)P<0.05；與miR-1285-NC組比較，(2)P<0.05；與miR-1285-mimics組比較，(3)P<0.05。

組別YAP1E-cadherin波形蛋白對照組1.15±0.120.21±0.051.13±0.12 miR-1285-NC組1.12±0.110.23±0.051.15±0.11 miR-1285-mimics組0.36±0.07(1)(2)0.97±0.09(1)(2)0.34±0.07(1)(2)miR-1285-mimics+YAP1組0.89±0.10(1)(2)(3)0.61±0.06(1)(2)(3)0.78±0.09(1)(2)(3)F 64.573157.87473.148 P<0.001<0.001<0.001

圖4 各組卵巢癌OVCAR3細胞中YAP1、E-cadherin、波形蛋白的表達(Western blotting)Fig.4 Expression of YAP1, E-cadherin and Vimentin protein in each group of ovarian cancer OVCAR3 cells (Western blotting)

3 討 論

卵巢癌的病死率居婦科腫瘤第一位，目前臨床上主要采用糖類抗原-125(CA-125)及人附睪蛋白作為血清標志物進行聯合檢查，但因為這兩種標志物在子宮內膜異位等婦科疾病及其他腫瘤中也可升高，導致其診斷卵巢癌的靈敏度較低，無法使卵巢癌患者獲得早期準確診斷，錯失了治療的最佳時機[6-7]。近年來，卵巢癌的手術及化療技術不斷改進，提高了患者的生存率，但由于化療耐藥性及患者個體差異的存在，根治性手術及術后化療的效果仍不理想，卵巢癌晚期患者術后仍有高達80%的復發率，因此，尋找可靠的生物標志物對患者預測預后具有重要意義[8-9]。miRNA表達失調與多種腫瘤的發生發展密切相關，且在不同腫瘤中發揮不同的作用，對腫瘤的診斷、治療及預后具有重要意義。

miR-1285最早被發現于人類胚胎干細胞中，可與p53特異性結合，通過調節p53的表達水平而發揮對腫瘤細胞的抑制作用[10]。本研究為探討miR-1285對卵巢癌細胞侵襲及遷移的影響，將細胞轉染miR-1285擬似物，結果顯示，miR-1285-mimics組細胞的miR-1285相對表達水平明顯高于對照組及miR-1285-NC組，與以往研究發現卵巢癌組織中miR-1285表達水平明顯低于癌旁組織的結果一致[11]，表明miR-1285在卵巢癌細胞中低表達，參與了卵巢癌的發生發展過程。本研究還發現，轉染miR-1285后細胞的侵襲及遷移能力下降，提示過表達miR-1285可能參與了抑制卵巢癌細胞侵襲及遷移的過程，從而發揮抑癌作用。以往研究發現，miR-1285在早期肺鱗狀細胞癌患者血清中的表達水平較低，可作為其早期診斷的分子標志物[12]。miR-1285在結直腸癌細胞中異常低表達，可通過調控下游相關基因抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，從而發揮抑癌作用[13]。本研究發現，卵巢癌細胞中miR-1285表達水平較低，與其他腫瘤中的研究結果一致，提示miR-1285可能參與了卵巢癌的發生發展過程，并與卵巢癌細胞的侵襲及遷移有關。

上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是腫瘤細胞發生侵襲及遷移的關鍵途徑，發生EMT的腫瘤細胞侵襲、遷移及抗凋亡能力增強，表現為上皮細胞標志物E-cadherin等表達下調，間質標志物波形蛋白等表達上調[14-15]。YAP1是一種癌蛋白，在胰腺癌、食管癌中異常高表達，對腫瘤細胞的增殖、轉移及生存能力具有促進作用，并可提高腫瘤細胞的抗凋亡能力及耐藥性[16-18]。本研究轉染miR-1285擬似物后，miR-1285-mimics組細胞E-cadherin表達上調，波形蛋白表達下調，提示miR-1285可阻止卵巢癌細胞發生EMT，從而阻止細胞發生侵襲及遷移。為探討miR-1285影響卵巢癌細胞EMT及侵襲、遷移的作用機制，本研究同時轉染過表達YAP1序列，結果發現在過表達miR-1285(miR-1285-mimics組)的卵巢癌細胞中，YAP1蛋白表達水平明顯低于對照組，細胞侵襲及遷移能力增強，而通過轉染過表達YAP1序列(miR-1285-mimics+YAP1組)后，YAP1蛋白表達明顯升高，同時細胞的侵襲及遷移能力明顯下降，提示miR-1285抑制卵巢癌細胞侵襲及遷移的機制可能是通過調控YAP1發揮作用的。Hu等[19]發現，過表達YAP1可逆轉miR-1285對骨肉瘤細胞增殖及侵襲的抑制作用，miR-1285通過靶向抑制YAP1蛋白而發揮對骨肉瘤細胞增殖及侵襲的抑制作用。Huang等[20]發現，miR-1285在胰腺癌細胞中通過負調控YAP1充當腫瘤抑制劑，抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲及遷移。本研究分別轉染miR-1285及YAP1，結果顯示miR-1285參與了YAP1蛋白表達的調控，可能通過調控YAP1蛋白相對表達水平而發揮抑癌作用。

綜上所述，卵巢癌OVCAR3細胞中miR-1285表達水平較低，過表達miR-1285可抑制OVCAR3細胞的侵襲及遷移，其機制可能是通過調節YAP1蛋白的表達而發揮作用，為miR-1285在臨床用于卵巢癌的分子靶向治療提供了理論依據。但本研究僅在體外細胞水平證實miR-1285對卵巢癌細胞的影響，其體內功能驗證及其他調控機制尚需進一步研究。