地克珠利納米乳含量測定方法的建立及穩定性研究*

丁 寧，洪偉鳴，張梁秋

(江蘇農牧科技職業學院，江蘇 泰州 225300)

地克珠利(Diclazuril)又名氯嗪苯乙氰，屬三嗪苯乙腈化合物，是一種聚酯類藥物，同時也是理想的抗球蟲藥物，具備高效、低毒、廣譜的特點[1]，廣泛用于雞、鴨和兔球蟲病，在水產養殖業中也得到一定應用。地克珠利在水中幾乎不溶，水溶性差成為限制地克珠利制劑發展的主要因素。納米乳(Nanoemulsion)制劑是指粒徑分布在1～100 nm，外觀澄清、透明且動力學和熱力學穩定的體系，其可以增加難溶性藥物的溶解度，提高生物利用度[2]，包括O/W型、W/O型、B.C型，其中O/W 型納米乳可以與水以任意比例互溶。本課題組針對地克珠利溶解度差的問題，將其溶解于適當的油相中，制備了O/W型地克珠利納米乳，極大提高了地克珠利的溶解度，以期為地克珠利新劑型開發提供理論依據。

1 實 驗

1.1 藥物與試劑

Diclazuril標準品(95%，批號:fy-m0222a)，南通飛宇生物科技有限公司購買。地克珠利納米乳(規格：20 mg/16 m:， 批號：20181210、20181211、20181212)，自研。乙腈(色譜純，批號：r181202)，甲醇(色譜純，批號：r181308),美國DIKMA；磷酸(分析純，批號：20180908)，冰乙酸(分析純，批號：20180920)，N，N-二甲基甲酰胺(分析純，批號：20181001),國藥集團。

1.2 含量測定

1.2.1 色譜條件

色譜柱為 Waters Xbridge C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈:水:磷酸:冰乙酸(54:46:0.15:0.15(V/V/V/V))；流速為1 mL/min；檢測波長為 280 nm；進樣量為 20 μL；柱溫為 25 ℃。

1.2.2 溶液的制備

對照品儲備液: 精密稱取20 mg地克珠利標準品于100 mL 容量瓶中，用 N,N-二甲基甲酰胺作溶劑溶解并定容[2]，然后搖勻，此即為對照品儲備液。

供試品溶液及陰性對照溶液:分別精密移取2 mL地克珠利納米乳樣品溶液和2 mL空白納米乳樣品溶液，分別置于50 mL 容量瓶中，各加入2 mL乙腈溶液，用超聲波清洗機超聲10 min后充分破乳，再用流動相稀釋定容至50 mL，搖勻后分別作為供試品溶液及陰性對照溶液。

1.2.3 系統適用性

分別取上述三種溶液按“1.2.1”項下色譜條件進樣、檢測，并記錄色譜圖。

1.2.4 標準曲線繪制

分別精密移取適量對照品儲備液于適宜規格的容量瓶中，用流動相配制成濃度為2.02、4.04、10.12、20.24 和40.48 μg/mL 的對照品系列溶液，在“1.2.1”項下色譜條件下分別進樣后記錄色譜圖。以地克利珠對照品系列溶液的濃度C及色譜峰面積 A分別作為橫縱坐標，線性回歸后繪制地克珠利對照品系列溶液標準曲線。

1.2.5 精密度

分別取濃度為 4.04、10. 12 和 40. 48 μg/mL 的地克珠利對照品溶液，在“1.2.1”項下色譜條件下連續進樣6 次，記錄色譜圖，并根據峰面積并計算RSD。

1.2.6 穩定性

取批號為20181210、20181211、20181212的三批地克珠利納米乳樣品，按照“1.2.2”項下處理方法，分別制備地克珠利納米乳供試品溶液，在室溫條件下靜置，于0、2、4、6、12 和 24 h取樣，在“1.2.1”項下色譜條件下進樣，記錄色譜圖，并根據峰面積并計算RSD。

1.2.7 重復性

取批號為20181210的地克珠利納米乳樣品，按照“1.2.2”項下處理方法，平行制備地克珠利納米乳供試品溶液6份，按“1.2.1”項下的色譜條件進樣，記錄色譜圖，并根據峰面積并計算RSD。

1.2.8 加樣回收率

分別精密量取“1.2.2”項下的供試品溶液4.0，3.4 和 2.6 mL 各3份，置于10 mL 容量瓶中，分別加入濃度為20.24 μg/mL的地克珠利對照品溶液4 mL，用流動相定容并搖勻。分別制成濃度為 120%、100%、80%的加樣回收率樣品溶液各3 份，進樣檢測并根據峰面積計算加樣回收溶液中地克珠利的含量，進而與理論含量進行比較，計算加樣回收率和RSD。

1.2.9 供試品含量測定

取批號為20181210、20181211、20181212的三批地克珠利納米乳樣品，按 “1.2.2”項下方法，分別制備地克珠利納米乳供試品溶液，在“1.2.1”項下色譜條件下進樣，記錄色譜圖，每批次樣品平行進樣3次，根據色譜圖峰面積計算地克珠利納米乳的含量。

1.3 樣品穩定性考察

1.3.1 影響因素試驗

取批號為20181210、20181211、20181212的三批地克珠利納米乳樣品各3份于50 mL 透明螺口瓶中,分別進行高溫(40 ℃恒溫)、高濕(相對濕度為75%，溫度為 25 ℃的恒溫)和強光(光照強度為4000 lx)試驗。以上影響因素試驗樣品分別在0、5、10天取樣，經建立的高效液相色譜法測定含量，并觀察外觀有無顏色變化、分層或絮凝的現象。

1.3.2 加速試驗

取批號為20181210、20181211、20181212的三批地克珠利納米乳樣品裝于50 mL 透明螺口瓶中，在溫度為32 ℃、濕度為65%的加速試驗條件下靜置6個月，分別在0、1、2、3、6月取樣，經建立的高效液相色譜法測定含量，并觀察外觀有無顏色變化、分層或絮凝的現象。

2 結果與討論

2.1 含量測定

2.1.1 系統適用性

圖1為對照品溶液色譜圖、圖2為供試品溶液色譜圖、圖3為陰性對照溶液色譜圖。由圖1～圖3可見，地克珠利吸收峰的保留時間為 7.7 min，供試品與對照品中地克珠利的保留時間一致且峰形較好，無明顯前沿、拖尾等現象，而陰性供試品在相應位置未出現吸收峰，表明地克珠利納米乳制備所使用的輔料對地克珠利高效液相色譜法測定含量無干擾，該方法專屬性好，適用于地克珠利納米乳含量測定。

圖1 對照品溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of reference solution

圖2 供試品溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of test solution

圖3 陰性對照溶液色譜圖Fig.3 Chromatogram of negative control solution

2.1.2 標準曲線繪制

以對照品系列溶液中地克珠利峰面積 A對地克珠利的濃度 C線性回歸，得繪制標準曲線 如圖4所示。得線性回歸方程為 A=38584C+4480.4(R2=0.9999)，地克珠利濃度在 2.02～40.48 μg/mL 范圍內其線性關系良好。

圖4 地克珠利標準曲線Fig.4 Dikezhuli standard curve

2.1.3 精密度

精密度試驗結果見表1，數據表明該檢測方法系統精密度良好，適用于地克珠利納米乳含量的測定。

表1 地克珠利高效液相精密度試驗結果Table 1 Precision test results of diclazuril by HPLC

2.1.4 穩定性

經測定，3 批樣品的穩定性實驗RSD值分別為 0.67%、0.55%和 0.69%，這表明地克珠利納米乳供試品溶液在室溫環境下24 h內穩定性良好。

2.1.5 重復性

根據檢測結果計算，地克珠利納米乳樣品溶液的重復性RSD值為2.14%，表明本方法適用于地克珠利納米乳樣品的含量測定，且重復性良好。

2.1.6 加樣回收率

根據檢測結果計算，3個濃度加樣回收率樣品的平均加樣回收率分別為100.38%、100.81%和101.87%，見表2，表明該方法用于測定地克珠利納米乳樣品加樣回收率較高。

表2 地克珠利加樣回收率試驗結果Table 2 Test results of sample recovery of diclazuril

2.1.7 供試品含量測定

根據檢測結果計算，3批地克珠利納米乳樣品含量分別為標示量的96.75%、97.79%、97.53%，見表3。

表3 地克珠利納米乳含量測定結果Table 3 Determination results of diclazuril nanoemulsion

2.2 樣品穩定性考察

2.2.1 影響因素試驗

經考察，3批地克珠利納米乳樣品影響因素試驗結果見表4。在高溫試驗條件、高濕試驗條件和強光試驗條件下地克珠利納米乳外觀無明顯變化，澄清、透明，且無分層或絮凝等情況。高溫、高濕和強光對其含量均無明顯影響。

表4 地克珠利納米乳影響因素試驗結果Table 4 Test results of influencing factors of diclazuril nanoemulsion

2.2.2 加速試驗

經考察，3批地克珠利納米乳樣品加速試驗結果見表5。在溫度為32 ℃、濕度為65%的加速試驗條件下，6個月內地克珠利納米乳樣品含量穩定，外觀澄清、透明且無分層或絮凝等現象。

表5 地克珠利納米乳加速試驗結果Table 5 Accelerated test results of diclazuril nanoemulsion

3 討 論

地克珠利具有水難溶性的特點，極大的限制了制劑的發展而影響到臨床應用。本實驗將地克珠利制備成O/W型納米乳，不僅提高了地克珠利的水溶性，且可以與水以任意比例混溶，提高臨床應用中藥物的給藥均勻性。O/W型地克珠利納米乳在含量測定時需要進行破乳，若破乳劑選擇不當或超聲破乳的時間和功率不足，將導致破乳不充分，影響高效液相檢測峰面積，使結果偏小。

目前，國內外地克珠利含量測定通常使用紫外分光光度法[11]、液-質聯用法[12]和高效液相色譜法[13]，本實驗中采用高效液相色譜法，方法簡單，方便快捷，實用性強。在建立高效液相色譜法測定地克珠利納米乳中地克珠利含量的方法中，考察了甲醇-磷酸、乙腈-磷酸、乙腈-冰乙酸、乙腈-磷酸-冰乙酸等流動相體系[13]，最終乙腈：水：磷酸：冰乙酸(54:46:0.15:0.15(V/V/V/V))體系作為流動相能明顯改善拖尾且理論塔板數高，因此選擇的流動相為乙腈：水：磷酸：冰乙酸(54:46:0.15:0.15(V/V))。