高效液相法測定南方紅豆杉中金松雙黃酮的含量*

林 芳，包 敏，吳澤君，肖人鐘，胡冠羽，易 穎，凌子懿，黃 昕

(1 株洲市食品藥品檢驗所，湖南 株洲 412000；2 湖南天大生物科技股份有限公司，湖南 長沙 410136)

南方紅豆杉是紅豆杉科植物南方紅豆杉Taxuschinensis(Pilg.)Rehd.var.mairei(LemeeetLevl.)ChengetL.K.Fu栽培品的干燥枝條。在我國用藥歷史悠久，具有消腫散結、通經利尿的功效，臨床上用于治療癥瘕積聚，風濕痹痛，水腫，小便不利。歷史悠久，具有消腫散結、通經利尿的功效，臨床上用于治療癥瘕積聚，風濕痹痛，水腫，小便不利。

化學成分研究表明，南方紅豆杉中有效成分主要為紫杉烷類、黃酮類、多糖類[1-3]。國內外對南方紅豆杉的研究主要集中在以紫杉醇為代表的紫杉烷類，而發揮南方紅豆杉藥材紫杉烷類、黃酮類、多糖類、酚類等多種活性成分的綜合功效，開展中醫藥臨床推廣應用，有效部位或活性成分提取、中藥新制劑研究等將成為今后的發展方向。南方紅豆杉中的黃酮類化合物含量高，且是一類具有獨特藥理活性的天然產物，具有降脂、抗血栓、抗腫瘤、抗氧化等作用。藥理研究發現，金松雙黃酮具有抑制腫瘤轉移、提高紫杉醇對腫瘤細胞的凋亡率的作用[4-6]。

本實驗建立了高效液相法測定金松雙黃酮含量的方法。并對湖南、浙江、江西、福建不同產地的11批南方紅豆杉金松雙黃酮的含量進行了考察，為全面評價其質量和開發利用提供科學依據。

1 儀器與試藥

儀器：Ultimate3000高效液相色譜儀、Chromeleon7數據處理系統，賽默飛有限公司；KQ5200DE型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；XSE205DU電子分析天平，梅特勒托利多有限公司。

藥材：南方紅豆杉藥材共11批，經株洲市食品藥品檢驗所吳澤君教授鑒定為紅豆杉科植物南方紅豆杉Taxuschinensis(Pilger.)Rehd.var.mairei(LemeeetLevl.)ChengetL.Fu的帶葉枝條。

試劑：金松雙黃酮，購自成都普瑞法科技開發有限公司(批號: PRF9110541,純度：98% )；乙腈(色譜純)，水為雙蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用AcclaimTM120 C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)柱，流動相：乙腈-0.2%冰醋酸(70:30)，流速:1 mL·min-1；檢測波長：330 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取金松雙黃酮對照品18.760 mg至50 mL量瓶中，加入少量DMSO溶解，再加甲醇定容至刻度，配制成濃度為442 μg·mL-1金松雙黃酮對照品母液，并用甲醇逐級稀釋成標準曲線溶液。

2.3 供試品溶液及空白溶液的制備

取藥材粉末(過三號篩)0.2 g，精密稱定，置錐形瓶中，加入甲醇-丙酮(3:1)25 mL，稱定重量，超聲30 min，放冷，再稱定重量，加甲醇-丙酮(3:1)補足重量，過濾，取續濾液即得供試品溶液。不加供試品，同法操作，即得空白溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察

精密吸取上述不同濃度的對照品溶液10 μL進樣，分別以對照品量C(ng)為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線并進行回歸計算，得到標準曲線回歸方程為：y=0.7609x+0.0153，線性范圍為：0.3677～183.85 μg·mL-1，r=0.9999，表明金松雙黃酮在線性范圍內線性關系良好。

2.4.2 檢出限及定量限

將對照品溶液逐級稀釋，以信噪比(S/N)為3所對應的濃度為檢測限，信噪比(S/N)為10所對應的濃度為定量限。結果金松雙黃酮的檢出限為0.01 μg·mL-1，定量限為 0.02 μg·mL-1。

2.4.3 精密度實驗

分別取同一供試品溶液，連續進樣6次，按照“2.1”項下色譜條件測定，結果是金松雙黃酮峰面積的RSD分別為:2.1%,顯示精密度良好(n=6)。

2.4.4 穩定性實驗

取同一供試品溶液，分別在0，2，4，6，12，24 h按“2.1”項下色譜條件測定，結果是金松雙黃酮的面積的RSD分別為:0.8%,表明金松雙黃酮在24 h內穩定(n=6)。

2.4.5 重復性實驗

取同一南方紅豆杉樣品6份，按照“2.3”項下操作，制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，結果是金松雙黃酮的面積的RSD分別為:2.6%，表明本方法具有較好的重復性(n=6)。

2.4.6 加樣回收率

取南方紅豆杉樣品0.1 g，精密稱定，共9份，分別加入適量的對照品，按“2.3”項下制備成供試品溶液，進行分析，計算加樣回收率，結果為金松雙黃酮的平均回收率為101.6%，RSD為4.5%。

2.5 樣品測定

取11批樣品，按照“2.3”項下操作，制備供試品溶液，按 “2.1”項下色譜條件測定，計算含量，結果見圖1和表1。

圖1 南方紅豆杉HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of Taxus chinensis var. mairei

表1 南方紅豆杉中金松雙黃酮的含量Table 1 Contents of sciadopitysin in Taxus chinensis var. mairei

3 討 論

3.1 提取方法的優化

本實驗考察了甲醇、丙酮、甲醇:水(8:2)、乙醇、乙醇:水(8:2)、甲醇:丙酮(1:1)、甲醇:丙酮(3:1)4種提取溶劑，結果以甲醇:丙酮(3:1)提取的效率高，考察了超聲、回流2種提取方法，兩種方法沒有顯著性差異，故選擇簡單操作的超聲處理，以甲醇:丙酮(3:1)為提取溶劑。

3.2 樣品測定

不同產地南方紅豆杉中金松黃酮成分的含量呈現一定的差異，最高為0.65%，最低為0.42%，可能與不同地域、不同采收時間有關，本項目將進一步研究。

綜上所述，本方法操作簡單，精密度、穩定性、重復性好，可用于南方紅豆杉中金松雙黃酮成分的測定。