華蟾素抗裸鼠原位肝細胞癌血管生成的超微超順磁性氧化鐵增強磁敏感加權成像研究

陸方，郭然，林江，楊爍慧，傅彩霞，劉孟瀟，俞健力

作者單位：1.上海中醫藥大學附屬曙光醫院放射科，上海201203；2.復旦大學附屬中山醫院放射科，上海200031；3.上海市影像醫學研究所，上海200031；4.上海市中醫醫院放射科，上海200071；5.西門子(深圳)磁共振有限公司應用開發部，深圳518057；6.西門子醫療系統有限公司科研市場部，上海201318

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)為我國第四位常見惡性腫瘤及第三位致死腫瘤。世界報道的HCC 病例中，我國占約55%，因HCC 而死亡患者中，有45%～50%亦發生在我國，因而嚴重威脅著我國人民的生命和健康[1,2]。肝細胞癌是富血供腫瘤，具有強大的誘導腫瘤血管生成能力，血管越豐富，患者預后越差[3]。因此，腫瘤新生血管已成為抗HCC 藥物作用的靶點之一，對于巴塞羅那肝細胞癌分期晚期或復發的HCC 患者，抗血管生成為重要治療手段[4]。我國傳統醫學中的一種產品化的中藥——華蟾素能夠用于抗中晚期惡性腫瘤血管生成的治療[5-6]。腫瘤血管生成一直是腫瘤生長和轉移的關鍵，且與預后密切相關，目前評價腫瘤內血管生成公認的“金標準”是病理學上通過穿刺或手術獲得組織標本并通過血管免疫組化染色及定量測量得到的腫瘤微血管密度(micro-vessel density，MVD)，但該法屬于有創檢查，而且容易受取材部位、操作者水平等的影響出現偏移。隨著磁共振磁敏感加權成像(susceptibilityweighted imaging，SWI)和特殊對比劑超微超順磁性氧化鐵(ultrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO)技術的發展，腫瘤內血管亦能被定量或者半定量評估[7-8]，使得無創且客觀地評價腫瘤內血管量成為可能。因此本研究的目的是通過USPIO增強三維磁敏感加權成像(three dimensional-susceptibility-weighted imaging，3D-SWI)來活體評價華蟾素抗裸鼠原位HCC腫瘤內大血管生成的有效性。

1 材料和方法

1.1 動物模型制作

本實驗研究經過復旦大學附屬中山醫院實驗動物管理委員會批準(批準日期：2017年4月10日)。

建立裸鼠原位HCC-LM3模型：首先無菌條件下將HCC-LM3 細胞(5×106/0.2 mL/site)注入周齡為4～6 周且體質量為23～25 g 的1 只雄性BALB/C 裸小鼠(購自中國科學院上海藥物研究所)左中外側腋下皮膚下后飼養。當腫瘤生長到長徑超過1 cm，將腫瘤取下并切成1 mm3大小的瘤塊若干分別接種入16 只雄性BALB/C 裸小鼠肝左葉包膜下后飼養21 天。隨后，荷瘤裸小鼠被隨機分成2 組，分別為華蟾素治療組和生理鹽水對照組，每組8只。其中華蟾素治療組荷瘤裸鼠每天腹腔注射華蟾素注射液(安徽華潤金蟾藥業股份有限公司，規格5 mL×10 支/盒) 0.2 mL，生理鹽水對照組荷瘤裸鼠每天腹腔注射0.9%的生理鹽水0.2 mL，共干預20天。

1.2 磁共振掃描

干預后的第21 天，所有荷瘤裸鼠用3%戊巴比妥鈉按40 mg/kg 的劑量經腹腔麻醉后，俯臥位固定于專用動物架上，行3.0 T MRI (MAGNETOM Skyra；西門子醫療，埃朗根，德國)掃描，使用8 通道小動物線圈(晨光，上海，中國)。先行常規磁共振掃描，序列和參數如下：橫斷位T2WI 快速自旋回波序列(重復時間/回波時間4000/65 ms；視野100 mm；翻轉角150°)，冠狀位T2WI 快速自旋回波序列(重復時間/回波時間4000/70 ms；視野100 mm；翻轉角150°)和橫斷位T1WI 快速自旋回波序列(重復時間/回波時間480/11 ms；視野100 mm；翻轉角131°)，掃描時間分別為1 min 56 s、2 min 28 s和2 min 4 s。

3D USPIO 增強橫斷位SWI 序列參數為：重復時間/回波時間205/10 ms；矩陣200×320；層厚1 mm；層間距0.2 mm；體素0.2×0.2×1 mm3；視野120 mm；翻轉角20°；帶寬380 Hz/Px；掃描時間，5 min 25 s。使用自動校準部分并行采集技術，加速因子2。所有荷瘤裸鼠用8 mg/kg 劑量的USPIO (鐵晶粒尺寸為6.1 nm，水合粒徑最大至20 nm，上海交通大學生物工程學院Med-X 研究所提供)用4.5 號靜脈輸液針經荷瘤裸鼠尾靜脈以0.1 mL/s的速率團注。注射完畢后經過5 min，等待USPIO 在血液中穩態分布后，行SWI掃描。原始圖像掃描結束后在線獲得SWI 后處理圖像，包括幅度圖、相位圖、最小密度投影圖和SWI圖。

1.3 磁敏感加權圖像評價

所有評價均在后處理獲得的SWI圖像上進行[7-8]。荷瘤裸鼠的圖像分別由具有14年和18年肝臟MRI診斷經驗的放射科副主任醫師在西門子后處理工作站上進行評價。該2 名副主任醫師均不知具體荷瘤裸鼠分組和病理情況。他們先瀏覽常規MRI圖像，包括T1WI、T2WI，目的是觀察有無明顯的腫瘤內出血。然后，該2 名副主任醫師在USPIO 增強SWI 上對腫瘤內磁敏感信號(intratumoral susceptibility signal，ITSS)計數后進行評分，一個月后經驗為18 年的副主任醫師進行ITSS 的第二次評價。ITSS 被定義為SWI圖像中腫瘤連續層面上均可追蹤到的上下延續的低信號沙礫或點狀結構，或一個層面上呈前后、左右分布的線樣或弧形結構、沙礫或點狀結構以及點狀與線樣或與弧形相混合[8]。這些結構在常規MRI序列上不可確切顯示。SWI 上腫瘤內較大顆粒狀低信號，同時T2WI 低信號，和/或T1WI 上高信號，并且不能前后層面追蹤，可能是出血成分，在計數和評分時需不計入在ITSS內。不連續模糊或淡片狀的低信號結構也需排除。在腫瘤中心層面進行ITSS 評分，采用0～5 分法：0 分，無ITSS；1 分，1～5 個；2 分，6～10 個；3 分，11～15 個；4 分，16～20 個；5 分，等于或大于21個ITSS。

1.4 腫瘤體積測量

腫瘤體積在USPIO 增強SWI 序列上進行。荷瘤裸鼠腫瘤于該序列上以相對高信號為主，肝臟則為低信號，因此兩者能夠清楚地區分開來。由一名具有10 年MRI 使用經驗的主管技師將該序列導入西門子syngo.via VB10 軟件，在腫瘤的每一個層面沿著腫瘤邊緣用手繪模式描繪出腫瘤邊界，然后自動計算獲得腫瘤體積。

1.5 組織學檢查

荷瘤裸鼠MRI 掃描結束后，立即處死，剝離腫瘤連同肝臟組織放入10%的緩沖甲醛溶液中，固定24 h以上。依據SWI 層厚，切取腫瘤中央約1 mm 的組織包埋在石蠟中再切成3 μm 厚度的薄片用于組織學檢查。行蘇木精伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色觀察腫瘤組織及細胞一般形態及結構情況。行免疫組織化學抗CD31 染色(一抗，Abcam，劍橋，英國)觀察腫瘤內血管情況。腫瘤MVD 獲取方法：所有抗CD31 染色切片使用Aperio ScanScope 和Leica SCN400 (Leica 生物系統；伊利諾伊州，美國)全景掃描后存儲為大約500～700 MB 大小的Aperio scn 文件，接著傳輸到電腦，使用SlidePath Gateway Client 軟件(Leica 生物系統)在3840×2160 像素的屏幕分辨率下進行血管計數[9]。具體步驟：由一名具有5 年從事肝癌研究經驗的醫師在不知荷瘤裸鼠具體分組和影像學結果的情況下，首先在全景圖低倍放大(4×和10×)的條件下瀏覽切片，分別找到5 個抗CD31 染色陽性血管最密集區域(熱點)；然后將每個熱點相應的區域放大到最高倍(40×)條件下，選取血管數量最多區域分別進行人工血管計數，取均值，獲得該腫瘤的MVD。

1.6 統計分析

根據前期研究ITSS 治療前后的數值[7]，在遵循“3R”——替代(replacement)、減少(reduction)、優化(refinement)的原則下，按照https://www.bu.edu/researchsupport/compliance/animal-care/working-with-animals/research/sample-sizecalculations-iacuc估算實驗動物樣本量。

統計學處理采用SPSS 18.0 (IBM，紐約，美國)軟件完成。計量數據用(均數±標準差)表示；等級資料用中位數(P25，P75)表示。Mann-WhitneyU檢驗用于評估兩組USPIO增強SWI圖像上ITSS評分、腫瘤體積以及病理切片的腫瘤MVD。Spearman 等級相關檢驗用于分析ITSS 評分與MVD 和腫瘤體積的相關性。相關程度通過相關系數(r)來判斷：0≤|r|＜0.2 不相關；0.2≤|r|≤0.4低度相關；0.4＜|r|≤0.6中度相關；0.6＜|r|≤0.8 高度相關和|r|＞0.8 極度相關。通過計算Kappa 值獲得觀察者間和觀察者內ITSS 評分一致性評價。所有P均為雙尾，P＜0.05 被認為差異有統計學意義。

2 結果

入組裸鼠原位HCC-LM3 模型樣本量估算：α 取0.05、β 取0.2，即以80%的概率達到P＜0.05 的統計顯著性所需的動物數量為16 只，即華蟾素治療組和生理鹽水對照組各8 只。

荷瘤裸鼠干預過程中，華蟾素治療組死亡3 只(3/8，37.5%)，生理鹽水對照組死亡1 只(1/8，12.5%)。華蟾素治療組荷瘤裸鼠死亡原因分別為肝彌漫性出血和腫瘤腹腔彌漫性轉移。生理鹽水對照組荷瘤裸鼠死亡原因為腫瘤腹腔彌漫性轉移，在后續存活荷瘤裸鼠取瘤過程中發現生理鹽水對照組1 只亦出現腫瘤腹腔彌漫性轉移。其余荷瘤裸鼠均未發現腫瘤腹腔彌漫性轉移和肝臟彌漫性出血。

肝臟成像序列在12 只存活荷瘤裸鼠中順利完成，獲得圖像沒有明顯的偽影(華蟾素治療組5 只，生理鹽水對照組7 只)。所有荷瘤裸鼠HCC 腫瘤呈類圓形或類橢圓形，在TIWI 上呈稍低信號，T2WI 上呈稍高信號，SWI 由于肝實質吸收USPIO 后信號下降呈低信號，腫瘤表現為相對高信號。腫瘤內出血表現為點、片狀T1WI 高，T2WI、SWI 低信號影。生理鹽水對照組中1 只荷瘤裸鼠、華蟾素治療組中2 只荷瘤裸鼠肉眼可見腫瘤內出血灶，于評估ITSS 時這些出血灶未計入在內。

華蟾素治療組腫瘤ITSS 評分顯著低于生理鹽水對照組(表1，圖1)。華蟾素治療組腫瘤體積與生理鹽水對照組相比未見明顯差異(表1)。華蟾素治療組腫瘤MVD顯著低于生理鹽水對照組(表1，圖2)。

圖1 HCC USPⅠO增強SWⅠ顯示生理鹽水對照組(A)和華蟾素治療組(B)裸鼠原位肝細胞癌腫瘤內ⅠTSS(白箭)評分分別為5和4，華蟾素治療組(B)腫瘤ⅠTSS明顯少于生理鹽水對照組(A) 圖2 CD31免疫組化染色顯示生理鹽水對照組(A)和華蟾素治療組(B)裸鼠原位肝細胞癌腫瘤內微血管(棕色)，華蟾素治療組(B)腫瘤微血管數明顯少于生理鹽水對照組(A)，圖像放大40倍Fig. 1 Ⅰntratumoral susceptibility signal intensity (ⅠTSS) (white arrows) in the cinobufacini treated and saline control tumors on USPⅠO-enhanced SWⅠ. Ⅰn the treated tumors,ⅠTSS is scored as grade 4(B),and in the saline control tumors,ⅠTSS is scored as grade 5(A).Fewer ⅠTSSs are noted in the treated tumors(B)than the saline control group (A). Fig. 2 Anti-CD31 immunohistochemistry staining shows brown tumor vessels of saline control group (A) and cinobufacini treated group(B)(magnification×40).Fewer tumor vessels are noted in the treated group(B)than the saline control group(A).

表1 生理鹽水對照組與華蟾素治療組主要指標比較Tab.1 Comparison of main indexes between cinobufacini treated group and saline control group

2 組12 只荷瘤裸鼠ITSS 評分與腫瘤MVD 高度正相關(r=0.647，P=0.022)；與腫瘤體積高度正相關(r=0.645，P=0.023)。2 組12 只荷瘤裸鼠腫瘤的ITSS 評分觀察者間和觀察者內Kappa 值分別為0.745 (P=0.0002)和0.750 (P=0.0001)。

3 討論

通過活體USPIO 增強SWI MRI 成像，本實驗研究發現裸鼠原位HCC-LM3 模型經華蟾素治療后ITSS 顯著減少，并且所有荷瘤裸鼠HCC-LM3 的ITSS 評分與病理MVD正相關。與生理鹽水對照組相比，華蟾素治療組腫瘤體積在未見明顯縮小的情況下，ITSS和MVD均減少，因此本實驗發現華蟾素能夠早期抑制HCC腫瘤內大血管生成。

3.1 USPIO 增強SWI MRI 成像評估HCC 腫瘤內血管的可行性

腫瘤細胞的增殖離不開腫瘤血管的生成。經過一段時間，腫瘤內“早期”血管生成和“晚期”血管形成共存，分別對應“微血管”與“大血管”[10-11]，兩者在腫瘤功能血管網中均必不可缺。評估抗腫瘤血管生成是否有效，不但是微血管，監測腫瘤內大血管也至關重要。然而，與正常組織的血管不同，腫瘤血管在形態學上和生物學上均不成熟，因而血管通透性較正常血管也高[12]。大分子對比劑USPIO 顆粒體積較大，不容易從血管壁擴散至細胞外間隙，我們的前期研究顯示USPIO 增強SWI MRI 中的ITSS 能較好地反映裸鼠原位HCC 腫瘤內大血管的情況[8]，并能夠活體無創監測HCC 大血管經靶向藥物抗血管生成的療效[7]。因此，代表腫瘤內大血管的ITSS是一種有效反映腫瘤內血管的影像學指標。目前，SWI ITSS 半定量評估已成功用于膠質瘤分級，Bhattacharjee 等[13]經過改良使用定量法ITSS血管容積(ITSS vasculature volume，IVV)排除了腫瘤內出血的影響，進一步提高了膠質瘤的分級的敏感度及特異度。Deguchi 等[14]研究發現ITSS還可用于預測中樞神經系統原發性淋巴瘤治療前對化療的反應。本實驗研究中使用順磁性大分子對比劑USPIO 進行SWI MRI 增強，較常規SWI更容易識別腫瘤內ITSS，進一步提高半定量評估的準確度。通過本實驗，我們發現USPIO 增強SWI MRI新技術可以作為一種有效評價華蟾素抗腫瘤內大血管的新方法，值得進一步開發和研究。

3.2 華蟾素抑制肝癌血管的生成。

目前，治療HCC靶向抗血管生成的藥物主要為侖伐替尼或索拉非尼。然而有研究指出這些藥物的運用并沒有明顯改善一部分患者的預后情況，還產生了耐藥性[15,16]。我國傳統醫學中重要組成部分——中藥，被用于抗惡性腫瘤血管生成的治療歷史悠久[17]。例如白花蛇舌草、蝎毒多肽、羥基紅花黃色素A、β-欖香烯和華蟾素等多種藥物被用于抗HCC 血管生成[18]。其中，華蟾素是一種成藥，有研究顯示華蟾素聯合三氧化二砷能夠抗裸鼠人肝癌移植瘤的血管新生，降低腫瘤的MVD[19]。也有研究指出華蟾素的主要成分——蟾毒靈，能夠通過介導經典血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)通路來加強索拉非尼抗HCC 血管生成作用[18]。本實驗研究亦觀察到與生理鹽水對照組相比，華蟾素治療組腫瘤體積在未見明顯縮小的情況下，ITSS 和MVD 均減少，證實了華蟾素能夠早期抑制HCC腫瘤血管生成。

3.3 華蟾素協同多激酶抑制劑治療肝癌的潛能

華蟾素與靶向藥多激酶抑制劑在抑制肝癌細胞的增殖，誘導肝癌細胞凋亡及抑制腫瘤血管生成等方面具有協同作用。Wang 等[18,21]研究發現，華蟾素主要活性成分蟾毒靈聯合索拉非尼通過靶向調節mTOR/VEGF信號通路，協同抑制肝癌細胞VEGF分泌進而抑制腫瘤血管生成；通過促進索拉非尼誘導的肝癌凋亡相關蛋白Bax，聚腺苷二磷酸核糖聚合酶和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8 的活化，蟾毒靈亦協同索拉非尼抑制肝癌細胞的增殖和促進肝癌細胞凋亡。華蟾素在上述方面表現出來的潛能值得我們今后利用USPIO 增強SWI MRI 等新技術對其聯合靶向藥物抗HCC 血管形成的協同機制進行進一步深入的活體可視化研究。

3.4 限制性及不足

本實驗研究中，我們發現華蟾素治療組荷瘤裸鼠的死亡率為37.5%，高于生理鹽水對照組，經解剖發現死亡的主要原因是肝臟的彌漫性出血，生理鹽水對照組中，雖有一只荷瘤裸鼠有彌漫性腹腔腫瘤轉移，但未見肝實質彌漫性出血。經分析華蟾素注射液具有活血化瘀的作用，它的副作用之一就是血小板減少，使用后出血的風險增加[20]。該結果提示在今后華蟾素抗惡性腫瘤的治療過程中可能需要監測實驗室凝血指標，并適當地增加升血小板的藥物。也提示在未來使用華蟾素干預的動物實驗中需要擴大樣本量或設計相應預案來保證實驗的可行性。

本實驗研究具有幾方面局限性。首先，裸鼠HCC腫瘤組織切片與SWI的掃描層面可能不完全匹配；由于腫瘤血管異質性，此切面獲得MVD也不能完全代表觀察腫瘤層面的大血管情況。第二，由于病理組織學技術上的困難，我們目前無法將ITSS 在病理上與HCC大血管進行直接比對。此外，免疫組化CD31染色切片上通過在切片最高倍數放大的基礎上進行人工MVD 計數，也會產生偏移，今后會通過軟件測量來增加結果的可靠性。第三，USPIO 在SWI 上具有放大效應[22]，所以對ITSS 評價只能進行人工半定量分析，而不能直接反映腫瘤大血管的真實數目。第四，雖然荷瘤裸鼠腫瘤內肉眼可見的出血灶在常規MRI 序列上已被排除，但腫瘤內微出血和USPIO被巨噬細胞吞噬均有可能影響ITSS 評分的準確性。第五，本研究實驗動物較少，但因為是動物實驗研究，又有腫瘤的病理學結果做對照，本著對動物倫理的遵循和實驗動物的有效利用，即“3R”原則，我們認為通過12只裸鼠HCC-LM3模型樣本量得出的實驗結果具可靠性。第六，本研究未進行治療前的基線測量，原因在于根據前期研究裸鼠原位HCC-LM3腫瘤的ITSS在21天的時候變化差異不大[7]。最后，即使細胞株相同，人體HCC 與動物模型HCC 仍不完全一致，華蟾素的治療效果也可能會不同，以后需要進一步的臨床研究。

綜上所述，通過USPIO 增強SWI MRI 成像研究，華蟾素能夠抑制裸鼠原位肝細胞癌腫瘤內大血管的生成。

作者利益沖突聲明：全體作者均聲明無利益沖突。